重組人免疫球蛋白D-Fc片段蛋白的構建

張 靜，陳文生，胡曉曦，黃 瓊，吳育晶，魏 偉

免疫球蛋白D(immunoglobulin D, IgD)作為一類免疫球蛋白，主要以膜結合形式作為B細胞受體發揮作用，也可少量以分泌形式作為抗體發揮作用[1]。病理狀態下IgD與T細胞上IgD受體(IgDR)的過度結合，可能導致自身抗體生成增多，自身免疫反應增強，從而介導自身免疫性疾病的發生[2]。IgD在一些類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)、系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)患者中高水平表達[3]。因此，以IgD-IgDR為治療靶點研發針對治療高水平IgD的自身免疫性疾病的新型生物制劑具有較好的臨床前景。該實驗首次制備出重組人IgD-Fc片段蛋白，并檢測重組人IgD-Fc片段蛋白在健康人CD4+T細胞上與IgDR結合的親和力大小，起到與IgD競爭IgDR的作用，為進一步研發針對高水平IgD自身免疫性疾病的新型生物制劑奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本收集安徽醫科大學健康志愿者外周血標本共20例，經安徽醫科大學倫理委員會批準，受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器人IgD蛋白(美國Abcam公司)；Jurkat、MOLT-4細胞株(中國科學院上海細胞庫)；胎牛血清(美國Gibco公司)；紅細胞裂解液(美國BD公司)；TRIzol 試劑(美國Invitrogen公司)；人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品有限公司)；CD4+T細胞免疫分選磁珠(德國美天妮試劑公司)；His-Tag親和層析柱(美國GE公司)；10 ku蛋白超濾管(美國Millipore公司)；瓊脂糖膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒(美國OMEGA公司)；IPTG(美國Sigma公司)；超聲細胞破碎儀(南京賽飛生物科技有限公司)；恒溫搖菌箱(美國Thermo公司)；蛋白純化儀(美國GE公司)；FC500流式細胞儀(美國Beckman Coulter 公司)。

1.3 方法

1.3.1pET28a(+)/IgD-Fc表達載體的構建

1.3.1.1健康人外周血cDNA獲取 向1 ml血液中加入3 ml紅細胞裂解液，室溫放置10 min后10 000 r/min離心1 min；棄上清液，加入1 ml TRIzol試劑混勻，室溫放置5 min后4 ℃、12 000 r/min離心10 min；取上清液，加入0.2 ml氯仿，振蕩15 s后冰上放置3 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取水相，加入等體積冰冷異丙醇，冰上放置20 min后4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入1 ml 75%乙醇，4 ℃、10 000 r/min離心2 min，棄上清液；室溫干燥10 min，加入20 μl DEPC水，溶解RNA；將RNA 反轉錄得到的cDNA 保存在-20 ℃待用。

1.3.1.2IgD-Fc基因片段的擴增及重組表達載體的構建 設計上游引物：5′-GCTAGCATGTGTCCGAGCC-3′，下游引物：5′-TCTGAGCTAGTTGAGCAGAGTCCG-3′，以上步cDNA為模板，擴增條件為94 ℃變性5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環，72 ℃延伸10 min。PCR產物進行電泳檢測并回收純化目的片段。將IgD-Fc PCR產物與pGMT-easy克隆載體連接，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞后均勻涂布于含氨芐霉素的培養板，挑取單克隆菌落，37 ℃搖菌培養12 h后堿裂解法抽提質粒。IgD-Fc pGMT- easy克隆載體雙酶切，pET28a(+)表達載體雙酶切，凝膠電泳分離并回收酶切產物，將雙酶切后的目的片段連接于pET28a(+)表達載體，轉化至DH5a，提取質粒，進行IgD-Fc表達載體酶切初步驗證和測序鑒定。

1.3.2重組人IgD-Fc片段蛋白的誘導表達 將pET28a(+)/IgD-Fc原核表達載體轉化至BL21(DE3)感受態細胞中，挑取單菌落于含卡那霉素的LB培基中，150 r/min擴大培養至OD600 nm值為0.6時加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，20 ℃誘導表達6 h。

1.3.3重組人IgD-Fc片段蛋白的親和層析、分子篩純化及產物測定 向離心后的菌液沉淀中加入適量裂菌液(NaH2PO4·2H2O 20 mmol/L，NaCl 500 mmol/L，甘油10%，Triton X-100 1%，PMSF 1 mmol/L，溶菌酶1 mg/ml)并重懸，冰上裂解30 min后冰浴超聲破碎15 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清液留存，SDS-PAGE分析IgD-Fc重組蛋白表達形式。采用His-Tag預裝柱純化IgD-Fc重組蛋白，收集洗脫產物后采用10 ku蛋白超濾管進行二次純化。將蛋白產物經SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色，通過掃描灰度值分析IgD-Fc重組蛋白純度。

1.3.4CD4+T細胞的分離、T淋巴瘤細胞株的培養 密度梯度離心法分離血液中單個核細胞，每107細胞加50 μl CD4+磁珠，混合均勻，30 ℃孵育30 min；加入1 ml BD清洗Buffer混勻后放至磁力架上孵育10 min；吸棄流式管內上清液，加入1 ml BD清洗Buffer，孵育5 min，并重復操作；重懸陽性成分，轉入含5%胎牛血清的RPMI-1640培養液中用于實驗。T淋巴瘤細胞株采用含10%胎牛血清的RPMI-1640、37 ℃、5% CO2進行培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3.5外周血CD4+T細胞和T淋巴瘤細胞株表面IgDR的表達 利用FITC熒光標記試劑盒標記人IgD蛋白(FITC-IgD)，具體操作參見說明書，向CD4+T細胞及Jurkat、MOLT-4細胞株中加入不同濃度的FITC-IgD，共同37 ℃孵育1 h，并設置空白對照組，PBS洗滌后適量重懸細胞，流式細胞儀檢測熒光強度。

1.3.6IgD與CD4+T細胞和T淋巴瘤細胞株表面IgDR的親和力實驗 將CD4+T細胞和Jurkat、MOLT-4細胞以2×106/孔的密度接種至6孔板，加入不同濃度FITC-IgD，37 ℃孵育2 h。PBS洗滌后適量重懸細胞，上機檢測熒光強度。各濃度組的熒光強度減去空白對照組熒光強度，得到各濃度組IgD的特異性結合量，分別以不同濃度FITC-IgD為X軸，特異性結合量為Y軸，繪制飽和曲線，計算最大結合量(Bmax)和解離常數(KD)[4]。

1.3.7CD4+T細胞的IgDR競爭結合實驗 CD4+T細胞以2×106/孔的細胞密度鋪6孔板，分別加入FITC-IgD(10 μg/ml)和不同濃度的重組人IgD-Fc片段蛋白(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 μg/ml)，37 ℃孵育2 h。PBS洗滌后適量重懸細胞，上機檢測熒光強度。

2 結果

2.1 重組人IgD-Fc片段蛋白的表達、純化

2.1.1pET28a(+)/IgD-Fc原核表達載體構建 通過PCR法擴增目的基因，連接克隆載體，雙酶切，連接表達載體。經凝膠電泳檢測(圖1)、測序鑒定(圖2)，序列正確，成功構建原核表達載體pET28a(+)/IgD-Fc。

2.1.2重組人IgD-Fc片段蛋白的表達 誘導后的上清在34 ku附近有一條明顯的條帶(圖3)，與理論值相符。而未轉化重組質粒的BL21(DE3)野生菌株在34 ku附近無明顯條帶。表明重組質粒在BL21(DE3)中誘導表達成功，且以可溶性蛋白形式存在。

2.1.3重組人IgD-Fc片段蛋白的純化 通過His-Tag親和層析和分子篩層析兩步純化，得到純度95%以上的重組人IgD-Fc片段蛋白(圖4、5)。

圖1 重組質粒pET28a(+)/IgD-Fc雙酶切鑒定

M：DNA Marker；1：空載體pET-28a(+)；2：重組質粒pET28a(+)/IgD-Fc；3、4：經雙酶切處理后的重組質粒pET28a(+)/IgD-Fc

2.2 CD4+T細胞和T淋巴瘤細胞株表面IgDR的表達FITC-IgD與IgDR結合后，流式細胞儀檢測細胞表面FITC熒光強度。結果顯示：隨FITC-IgD濃度增高，流式峰圖顯著右移，證明CD4+T細胞(圖6)、Jurkat和MOLT-4細胞(圖7、8)上均有IgDR表達。

2.3 IgD與CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株表面IgDR的親和力不同濃度FITC-IgD與細胞共同孵育后流式細胞儀檢測FITC熒光強度，結果顯示隨FITC-IgD濃度增加，結合到IgDR上的配體逐漸增多，結合到IgDR的IgD可通過流式細胞儀檢測其FITC平均熒光強度(MFI)并繪制飽和曲線(圖9)，分別計算IgD與CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株表面IgDR結合的Bmax和KD。結果顯示, CD4+T細胞(Bmax=4 502±144.6,KD=7.254±0.956 7,R2=0.975 1)、Jurkat(Bmax=2 722±112.7, KD=9.876±1.589,R2=0.963 2)、MOLT-4細胞(Bmax=2 751±100.2, KD=7.88±1.161,R2=0.968 9)表面IgDR與IgD親和力相近。

圖2 原核表達載體pET28a(+)/IgD-Fc測序圖

圖3 IgD-Fc重組蛋白表達產物的SDS-PAGE電泳檢測

M：蛋白Marker；1、2、3：大腸桿菌BL21(DE3)總蛋白；4、5、6：轉化pET28a(+)/IgD-Fc的BL21(DE3)總蛋白

圖4 重組人IgD-Fc片段蛋白His-Tag親和層析純化峰圖

圖5 重組人IgD-Fc片段蛋白的純化

M：蛋白Marker；1、2：大腸桿菌BL21(DE3)總蛋白；3：親和層析純化產物；4：第二步純化流穿產物；5：分子篩層析產物

圖6 CD4+T細胞表面IgDR表達

圖7 Jurkat細胞表面IgDR表達

圖8 MOLT-4細胞表面IgDR表達

2.4 重組人IgD-Fc片段蛋白、IgD與CD4+T細胞表面IgDR的競爭結合實驗不同濃度重組人IgD-Fc片段蛋白與10 μg/ml FITC-IgD共同孵育CD4+T細胞，流式細胞儀檢測FITC熒光強度。結果顯示隨蛋白濃度增加，細胞表面FITC強度逐漸減弱，提示重組人IgD-Fc片段蛋白濃度依賴性地降低了IgD與IgDR的結合。根據FITC熒光強度的變化繪制重組人IgD-Fc片段蛋白針對IgD/IgDR結合的抑制曲線(圖10)，分別計算IC50值，結果顯示，重組人IgD-Fc片段蛋白(IC50=6.927, Log IC50=0.840 5±0.077 89,R2=0.893 4)可競爭性結合IgDR。

3 討論

人IgD是由兩條相同的輕鏈和重鏈組成具有Ig超家族特征的可變區(V)和恒定區(C)[5]，其Cδ3段由于部分脯氨酸殘基缺失以及N端兩個糖基化位點而區別于其他Ig，正是這種結構導致IgD的特殊生物學特性[6]。IgD的兩個Fab片段主要位于Fc片段兩側，由于半延伸鉸鏈的靈活性，Fab可以圍繞Fc片段自由旋轉，因此能在較低濃度下促進抗原結合[7]。

圖9 IgD與CD4+ T細胞、Jurkat 細胞、MOLT-4細胞上IgDR結合的飽和曲線

圖10 CD4+T細胞上IgDR的競爭結合實驗

自身免疫性疾病是由于對自身抗原失去免疫耐受而引發的一種慢性疾病，表現為一種可能涉及宿主體內多個器官的異質性疾病群[8]。遺傳易感性和環境誘因使T細胞逃避中樞和外周耐受性，對自身抗原產生自激反應，抵抗自身抗原的T細胞過度增殖而導致器官損傷[9]。臨床顯示，自身免疫性疾病患者血液中分泌型IgD(sIgD)水平較高，如：RA、SLE等[3]。Nguyen et al[10]研究認為，抗IgD抗體可以調節人固有和適應性細胞因子反應，以抗IgD為靶點可能在自身免疫性疾病治療中有一定的應用價值。T細胞上IgDR交聯可以抑制T細胞凋亡，且IgDR能夠促進同源T細胞和初始B細胞間免疫突觸的形成，增加抗原呈遞和抗體產生。RA是一種炎癥自身免疫性疾病，抑制T細胞過度活化被認為是RA的潛在臨床治療方法[11]。研究[3,12]顯示，相比健康對照者，IgD水平及IgDR的表達在RA患者中更高，且IgD可誘導RA患者T細胞異常活化。IgD也可促進健康人CD4+T細胞增殖與活化[13]和T淋巴瘤細胞株Jurkat、MOLT-4的異常增殖。以上結果提示在自身免疫性疾病中T細胞處于過度活化狀態，異常升高的IgD和IgDR水平可能在T細胞異常增殖與活化過程中扮演重要角色，而IgD-IgDR可能成為IgD水平升高的自身免疫性疾病治療的新靶點。

課題組在蛋白構建過程中，嘗試了三種IgD片段的重組：① 全長IgD，由于全長IgD包含了IgD的功能域與結合域，故表現出與IgD相近的功能，未能起到阻斷IgD的促增殖作用；② IgD-Fc片段，去除了IgD的Fab段，仍未起到阻斷IgD功能的作用，提示IgD-Fc中包含了IgD的功能域及結合域；③ IgD重鏈CH2-CH3結構域，成功阻斷了IgD的促增殖作用。綜上，經蛋白活性篩選，確定了IgD-CH2-CH3重鏈結構域才是有藥理活性的理想IgD片段。本實驗以IgD-IgDR為靶點，成功擴增出含人IgD重鏈CH2-CH3段結構域的基因片段，構建了含有該段基因的克隆及原核表達載體，并進行原核蛋白表達和層析純化，制備出重組人IgD-Fc片段蛋白。與分離天然來源和化學合成相比，在大腸桿菌中重組表達是一種更經濟有效的大規模生產重組蛋白的方法[14]。本實驗采用低誘導溫度(20 ℃)和低IPTG濃度(0.4 mmol/L)，通過減慢蛋白合成速率，增加蛋白正確折疊，為重組蛋白的正確表達提供了更有利的條件。pET 載體系統是一種能高效表達重組蛋白的載體蛋白，具有高度特異性和穩定性，在外源基因的原核表達中具有廣泛的應用價值。

本實驗檢測了CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株Jurkat和MOLT-4表面IgDR的表達情況，進行IgD與CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株Jurkat和MOLT-4表面IgDR的親和力比較，以及重組人IgD-Fc片段蛋白與CD4+T細胞表面IgDR的競爭結合比較。結果表明，CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株表面均有IgDR表達，CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株表面IgDR與IgD親和力相近，重組人IgD-Fc片段蛋白可以競爭性結合IgDR，濃度依賴性地降低IgD與IgDR的結合，阻斷IgD-IgDR通路，抑制IgD誘導的T細胞過度活化，為進一步研發針對高水平IgD的自身免疫性疾病的新型生物制劑奠定了實驗基礎。