兒童患者耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的流行病學特征及耐藥性分析

李惠春，丁圣剛，卜笑松，王 建，王 旺，朱玉林

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)簡稱金葡菌，是兒童感染的重要病原菌，它通過定植在人類和哺乳動物身上，引起皮膚軟組織的化膿感染，甚至引起機體內部炎癥如心內膜炎、骨髓炎、膿毒癥等危及生命的全身性感染。隨著抗生素的研發與應用，這些感染曾一度得到控制，但是隨著抗生素種類的增多與廣泛應用，出現了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)[1]。MRSA不僅對青霉素耐藥，對和青霉素結構相同或相似的β-內酰胺類抗生素均耐藥，甚至對氨基糖苷類、大環內酯類、喹諾酮類等抗菌藥物產生耐藥，給臨床治療帶來巨大困難[2]。而攜帶殺白細胞素(panton-vanlentine leukocidin，pvl)基因的MRSA殺傷力更強，pvl是由一個分子量為34 ku的lukF-PV蛋白和一個分子量為32 ku的lukS-PV蛋白組成的雙蛋白毒素成分，這兩分子協同發揮作用導致多形核白細胞膜穿孔，從而殺傷白細胞[3]。有研究[4]顯示其陽性率與皮膚軟組織反復感染甚至引起壞死性肺炎密切相關。該研究通過對738株SA進行mecA、pvl基因檢測及藥敏試驗，并對所有菌株的科室來源、標本來源來及耐藥性進行統計學分析，了解安徽省各地區兒童與>14歲患者之間感染MRSA的流行病學特征及耐藥性差異，為兒童SA感染的治療提供病原學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源安徽省內各地區共計39所醫院(包括10家省三級甲等醫院、15家市三級甲等醫院、1家縣三級甲等醫院、2家市三級乙等醫院、5家市二級甲等醫院、4家縣二級甲等醫院、1家三級民營醫院、1家檢驗中心)上報至安徽省細菌耐藥監控中心金黃色葡萄球菌738株(包括來源于兒童患者菌株153株與來源于>14歲患者菌株585株)，將所有菌株菌株按年齡分為兒童患者組與>14歲患者組，并對所有菌株科室來源及標本來源進行歸類整理。標準質控菌株ATCC25923(普通金黃色葡萄球菌，不含耐藥基因)及MRSA標準質控菌株ATCC43300(含mecA耐藥基因)均為安徽省細菌耐藥監測中心提供。

1.2 主要試劑及儀器VITEK-2型全自動微生物鑒定儀及配套的鑒定板和藥敏板購自法國生物梅里埃公司；溶葡萄球菌酶、premixtaq、1 000DL Marker均購自上海生物工程有限公司；PCR擴增儀器購自德國Biometra公司；電泳儀儀器購自北京市六一儀器廠；凝膠成像系統購自上海天能科技有限公司。

1.3 菌株的鑒定及藥敏試驗通過VITEK-2型全自動微生物鑒定儀進行金黃色葡萄球菌鑒定及藥敏試驗(使用配套鑒定板GP21 342及藥敏卡PC33)，質控菌株為ATCC25923及MRSA標準質控菌株ATCC43300，按照2018年CLSI標準[5]判讀藥敏結果。

1.4 mecA、pvl引物的制備PCR擴增mecA、pvl的引物參照文獻[6]設計，并委托上海生物工程有限公司合成，置于-20 ℃無菌冰箱儲存備用，使用時遵使用說明合成相應溶液。具體引物序列見表1。

表1 mecA、pvl基因擴增引物

1.5 提取目的基因將臨床分離提純的738株SA全部接種至直徑為9 mm的培養皿中，置于37 ℃無菌培養箱中培育18～24 h，用無菌棉簽鈍頭分別從各個培養基中挑取4～5個菌落溶于裝有200 μl滅菌雙蒸水的尖頭EP管中，各加入10 μl溶葡萄球菌酶置于37 ℃恒溫箱中水浴30 min，然后放入電飯鍋中煮沸10 min，13 000 r/min離心10 min，最后收集上清液至EP管中，即為PCR擴增所需模板基因。

1.6 PCR技術擴增mecA及pvl基因產物

1.6.1反應體系 分別往8連管每個管中各加入滅菌雙蒸水10.5 μl、premix taq 12.5 μl、目的基因1 μl、上下游引物各0.5 μl，配置成25 μl反應體系，經低速離心30 s充分混勻。

1.6.2反應條件 95 ℃預變性5 min，然后開始95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸39 s，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保護，即擴增出所要目的基因片段。

1.7 凝膠電泳PCR產物用含0.5 μg/ml EB的2%瓊脂糖凝膠，在1×TAE緩沖液中，100 V電泳90 min，在紫外燈下觀察結果，片段長度為162 bp片段即為PCR擴增所得的mecA片段，片段長度為78 bp片段即為PCR擴增所得的pvl片段。

1.8 統計學處理應用SPSS 17.0 軟件對臨床統計資料及實驗所得數據進行分析，MRSA科室來源及標本來源用成組設計行×列表資料的χ2檢驗進行分析，MRSA的耐藥性差異用成組設計四格表資料的χ2檢驗進行分析，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mecA、pvl基因的PCR結果738株SA共檢出MRSA 126株，MRSA陽性率為17.07%，檢出pvl陽性菌株36株，陽性率為28.57%，其中分離自兒童患者的153株SA檢出為MRSA菌株共計32株，陽性率為20.92%，pvl陽性MRSA菌株7株，陽性率為21.88%，分離自年齡>14歲患者的585株SA檢出為MRSA菌株94株，陽性率為16.07%，pvl陽性MRSA菌株29株，陽性率為30.85%，兒童患者與>14歲患者感染SA之間檢測mecA及pvl差異無統計學意義(P>0.05)。部分mecA、pvl電泳圖見圖1。

圖1 部分MRSA mecA凝膠電泳成像圖譜

M：Marker；1～10：MRSA菌株；11～14：pvl陽性MRSA菌株；15：pvl陽性對照菌株菌株16;標準質控菌株ATCC43300；17：陰性對照菌株ATCC25923

2.2 MRSA菌株來源科室統計分析兒童患者感染MRSA主要來源于燒傷科(31.25%)、外科(15.63%)、ICU(9.38%)，與>14歲患者感染MRSA來源科室之間差異有統計學意義(χ2=40.697,P<0.001)。其中兒童感染pvl(+)MRSA主要來源于外科(57.14%)、新生兒病區(28.57%)、呼吸內科(14.29%)，與>14歲患者感染pvl(+)MRSA來源科室之間差異有統計學意義(χ2=29.914,P=0.000)，具體來源科室構成比見表2。

2.3 MRSA菌株來源標本統計分析兒童感染MRSA主要來源標本為膿液(31.25%)、痰(25.00%)、創面(15.63%)，與>14歲患者感染MRSA主要來源標本之間差異有統計學意義(χ2=18.055,P=0.003)。兒童感染pvl(+)MRSA主要來源于膿液(71.43%)、血(28.57%)，與>14歲患者感染MRSA主要來源標本之間差異有統計學意義(χ2=14.593,P=0.006)。見表3。

表2 兒童與>14歲患者感染MRSA、pvl(+)MRSA科室來源構成比[n(%)]

表3 兒童與>14歲患者感染MRSA、 pvl(+)MRSA臨床標本來源構成比[n(%)]

2.4 MRSA、MSSA耐藥性統計分析不同種類金黃色葡萄球菌對20種常見抗生素的耐藥性差異用成組設計四格表資料的χ2檢驗進行統計學分析。其中兒童與>14歲患者感染pvl(+)MRSA對各種常見抗生素的耐藥性差異均無統計學意義(P>0.05)。兒童與>14歲患者感染pvl(-)MRSA除對慶大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平、四環素的耐藥性差異有統計學意義(P=0.004、0.004、0.012、0.021、<0.001)，其余15種常見抗生素的耐藥性差異無統計學意義(P>0.05)。兒童感染pvl(+)MRSA與pvl(-)MRSA對克林霉素、環丙沙星、慶大霉素的耐藥性差異有統計學意義(P<0.001、<0.001、P=0.009)。具體MRSA對各種抗生素的耐藥率構成比見表4。

表4 兒童與>14歲患者感染MRSA對各種常見抗生素的耐藥率構成比[n(%)]

3 討論

SA廣泛存在于自然界中，是兒童感染的常見病原菌，由于抗生素使用不合理及過度泛濫，導致機體菌群失調、重新分配，大部分敏感菌被清除，MRSA在抗生素的選擇壓力下富集。有研究[7]報道近年來兒童感染MRSA率有急劇上升趨勢，胡龍華 等[8]報道2007～2008年南昌地區兒童MRSA檢出率為10.6%，張秀平 等[9]報道2010～2015年某醫院兒童MRSA的檢出率從21.74%上升到75.59%。由于兒童免疫力較低下，且MRSA菌株多為多重耐藥菌，感染后常導致嚴重后果，如陳雨青 等[10]報道12例MRSA感染導致膿毒癥患兒經手術、閉式引流及充分藥物治療后仍有4例不幸死亡。隨著MRSA的臨床分離率逐年升高且呈多重耐藥，兒童一旦感染，病情常較嚴重且呈急劇進展趨勢，能用于治療的藥物越來越少，臨床治療十分困難，給患兒及親屬帶來嚴重的身心傷害。

本研究結果顯示，2017年9月份安徽省內各地區兒童患者與>14歲患者感染金葡菌的mecA、pvl基因檢出率差異無統計學意義(P>0.05 )，提示在安徽省內MRSA是兒童患者與>14歲患者感染的同等重要病原菌。MRSA總檢出率為17.07%，兒童患者MRSA的檢出率為20.9%，低于2014年中國細菌耐藥性監測顯示的MRSA平均檢出率44.6%及兒童MRSA平均檢出率23.8%～37.6%[11]。其中pvl陽性MRSA菌株7株，陽性率為21.88%，低于李士朋 等[12]報道的pvl檢出率42.1% ，可能提示安徽省內各地區抗生素使用較合理，MRSA感染防治較好，但不排除MRSA季節性低發期，由于MRSA檢出率仍較高，仍應加強MRSA感染的防治意識。

本研究結果顯示，安徽省各地區兒童患者與>14歲患者感染MRSA主要來源科室之間差異有統計學意義(P<0.001)。提示兒童患者感染MRSA主要來源于創傷、危重科室，如燒傷科(31.25%)、外科(15.63%)、ICU(9.38%)，主要來源科室與李麗民 等[13]報道相似。其中pvl(+)MRSA主要來源于外科(57.14%)、新生兒病區(28.57%)、呼吸內科(14.29%)。可能因為燒傷科患兒第一道保護屏障皮膚的受損及體液的丟失，易導致各種病原菌的入侵；外科患兒因為手術創傷并常伴有身體免疫力的降低，易發生各種感染，要求臨床醫護人員手術過程中嚴格遵循無菌操作規則，術后加強對患兒的護理，避免感染；ICU患兒病情危重，加上機械插管、中心靜脈導管靜置等治療設施更易發生各種感染，而一旦感染MRSA常導致病情加速惡化，甚至危及生命。本研究提示外科、燒傷科、ICU是兒童患者MRSA感染的常見科室，其中外科、新生兒病區、呼吸內科是pvl(+)MRSA感染的常見科室，因此要注意這些科室患兒感染金葡菌的mecA及pvl基因檢測，以便進行及時有效的防治。

本研究結果顯示，安徽省各地區兒童患者與>14歲患者感染MRSA主要來源標本之間差異有統計學意義(P<0.05)。提示兒童感染MRSA主要來源標本為膿液(31.25%)、痰(25.00%)、創面(15.63%)，pvl(+)MRSA主要來源于膿液(71.43%)、血(28.57%)，與相關報道[10]血、穿刺液、分泌物、膿液MRSA的檢出率分別為68.97%、66.00%、55.81%、54.47%不一致。不一致原因可能為分離菌株來源地區范圍、時間點不一樣。提示安徽省各地區兒科患者MRSA主要來源于皮膚軟組織感染，其次為呼吸系統感染，臨床兒科醫師應加強以上標本MRSA感染的意識，加強與檢驗醫師的臨床合作，注意以上標本金葡菌mecA及pvl基因的檢測，以便更及時地發現MRSA感染患者并及時進行救治，從而達到更好的治療效果。

本研究結果顯示，安徽省各地區兒童患者與>14歲患者感染MRSA對多數常見抗生素的耐藥性差異均無統計學意義(P>0.05)，但感染pvl(-)MRSA對慶大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平、四環素的耐藥性差異有統計學意義(P=0.004、0.004、0.012、0.021、<0.001)，提示兒童與>14歲患者感染MRSA的耐藥性多數相似，僅對以上幾種抗生素的耐藥性有差異，應注意根據年齡及pvl基因攜帶情況對以上藥物進行合理應用。兒童感染pvl(+)MRSA與pvl(-)MRSA對克林霉素、環丙沙星、慶大霉素的耐藥性差異具有統計學意義(P<0.001、<0.001、P=0.009)，提示兒童感染pvl(+)MRSA與pvl(-)MRSA具有不同的耐藥模式。兒童感染pvl(+)MRSA主要表現對β-內酰胺類、大環內酯類、氨基糖苷類、四環素類、林克酰胺類耐藥，其耐藥率分別為100%、100%、28.6%、28.6%、14.3%；pvl(-)MRSA主要對β-內酰胺類、林克酰胺類、大環內酯類、氨基糖苷類、喹唑酮類、喹諾酮類、磺胺類、四環素類等具有不同的耐藥譜，其耐藥率分別為100%、88%、80%、80%、76%、20%、16%、12%，與李冬梅 等[14]報道的MRSA耐藥率相似，與魏丹丹 等[15]報道的MRSA耐藥率有所不同，可能與各個地方的地理環境、用藥習慣有關，提示不同地方的MRSA具有不同的耐藥模式。當今社會由于抗生素的濫用，兒童感染MRSA的分離率逐年增加，且多為多重耐藥菌，MSSA也開始出現耐藥菌，給臨床治療帶來巨大挑戰，給患兒及家屬帶來巨大身心傷害，臨床兒科醫師應盡量避免經驗用藥，注意根據藥敏結果制定治療方案。