龍血竭總黃酮對免疫性肝纖維化大鼠肝臟中TGF-β1表達的影響

李 睿，江揚帆，童 琳，馬 征，王 超，羅勝勇，許冬瑞

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由于多種慢性疾病導致的肝臟持續(xù)受到損傷并引起肝臟內纖維結締組織異常增生的病理過程。其中肝細胞外基質(extracelluar matrix，ECM)的過度沉積是引起HF的主要發(fā)生機制[1-2]。而肝臟中肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)表型的激活及過度增殖又是引發(fā)ECM過度沉積的重要誘因。目前觀點認為轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)是促進HSC合成ECM的主要細胞因子，其主要是通過與細胞膜上的高親和力的受體(TβR)結合激活胞內的信號通路使HSC活化并增殖，同時產(chǎn)生膠原并抑制ECM的降解[3]。

龍血竭為百合科植物劍葉龍血樹[draeaena cochinchinensis (lour)S. C. Chen]的含脂木材的乙醇提取物，其具有抗炎、增加冠狀動脈血流、抑制血小板聚集、促進組織創(chuàng)面愈合再生、降低一氧化氮合酶(NOS)活性等多種藥理學作用[4]，而其中最主要的有效成為龍血竭總黃酮(SanguisDraconisflavones，SDF)。前期實驗也顯示，SDF對四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導的小鼠急性化學性肝損傷模型具有明顯的保護作用，其能夠降低小鼠血清中透明質酸(hyaluronic acid，HA)酶、層粘連蛋白(laminin，LN)和Ⅳ型膠原(collage type Ⅳ，CⅣ)及谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的水平，同時改善HF大鼠的肝臟病理損傷程度，但其在機體內的分子機制尚不明確，該研究通過建立大鼠的免疫性肝纖維化(immune hepatic fibrosis，IHF)模型來進一步研究SDF在HF中的作用機制及尋找HF潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物80只SPF級健康SD大鼠，體質量80～100 g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(浙)2014-0001；合格證號：NO1708170009。

1.2 主要試劑SDF購自廣西中醫(yī)藥研究院，紅棕色粉末，批號：2017年1月4日，用紫外分光光度法測定其中總黃酮含量在70%以上，臨用前用0.5%的CMC-Na溶液配制成質量濃度分別為36、18、9 mg/ml的SDF混懸液備；豬血清購自奧地利PAA公司(批號：A07222-764)；秋水仙堿片(0.5 mg/片)購自西雙版納版納藥業(yè)有限責任公司(批號：170124)，臨用前用蒸餾水配制成質量濃度為0.01 mg/mL的秋水仙堿混懸液備用；大鼠HA ELISA試劑盒、大鼠Ⅲ型前膠原( procollagen type Ⅲ，PCⅢ)ELISA劑盒、大鼠LN ELISA試劑盒和CⅣ ELISA試劑盒均購自廈門康研生物技術有限公司(批號：170123)；環(huán)磷腺苷(cAMP)ELISA試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司(批號：170201)；抗TGF-β1抗體(sc-130348)購自美國Santa Cruz公司；抗β-actin抗體(sc-47778)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；增強化學發(fā)光試劑(ECL)購自美國Pierce公司。

1.3 主要儀器800型離心機(上海手術機械廠)；MODEL 550酶標儀(日本BIO-RAD公司)；FSH-2型可調高速勻漿器(金壇金南儀器制造有限公司)；可控硅控溫水浴鍋(通州滬通實驗儀器廠)；Axioscope A1型病理成像顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；JY200C電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；DYCZ-40D型轉印電泳槽、DYCZ-24D型雙垂直電泳槽(北京市六一儀器廠)。

1.4 實驗方法

1.4.1模型建立及分組[5]SD大鼠80只，實驗前適應性飼養(yǎng)1周，取其中狀態(tài)良好的大鼠60只(雌雄各半)隨機分成6組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、陽性組，SDF低、中、高劑量組。除正常對照組外，其余各組大鼠腹腔注射豬血清，每只每次注射0.5 ml，2次/周，連續(xù)注射16周。自造模第12周開始，SDF低、中、高劑量組分別灌胃給予90、180、360 mg/kg SDF混懸液，陽性組灌胃給予秋水仙堿溶液0.1 mg/kg，給藥容積均為1 ml/100 g，正常對照組與模型組灌胃給予等量蒸餾水，每日1次，連續(xù)4周。實驗期間所有動物置于安徽省醫(yī)學科學研究院屏障環(huán)境實驗室常規(guī)飼養(yǎng)，溫度18～24 ℃，相對濕度40%～70%，自由飲水攝食。

1.4.2動物標本取材 末次給藥后(禁食12 h)1 h，稱空腹大鼠體質量，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開腹腔，腹主動脈取血5 ml離心并取血清，4 ℃冷藏待做ELISA時使用。同時于大鼠腹腔上部仔細分離得到肝臟組織。

1.4.3肝臟組織形態(tài)變化觀察 取各組大鼠肝臟左葉置于10%福爾馬林溶液中固定，之后逐級乙醇脫水，石蠟包埋，切片，厚4 μm，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝臟組織結構的變化。每只大鼠肝臟的纖維化程度按照表1進行分級判定并記分，同時采用半定量法進行統(tǒng)計評價。

1.4.4ELISA法檢測血清中HA、PCⅢ、LN和CⅣ的含量 將大鼠腹主動脈抽取的5 ml全血置于室溫自然凝固20 min，之后以3 000 r/min、4 ℃離心20 min后取上清液按照試劑盒說明書測定大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和CⅣ的水平。

表1 肝臟纖維化程度判定標準

1.4.5ELISA法檢測肝臟組織中cAMP的含量 從大鼠剩余肝臟中剪取出0.5 g左右肝組織，加入1 ml 0.9%NaCl溶液，用高速勻漿機在冰浴上進行勻漿，以3 000 r/min、4 ℃離心20 min后取上清液按照試劑盒說明書測定肝臟組織中cAMP的水平。

1.4.6TGF-β1蛋白表達的定量分析[6]從剩余大鼠肝臟織中剪取出0.5 g組織并提取其中的總蛋白，選擇5%的濃縮膠和10%的分離膠進行SDS-PAGE分析。電泳結束后將凝膠上的蛋白轉印到PVDF上，37 ℃用脫脂牛奶封閉3 h，用3 ml的1 ∶500稀釋的抗體4 ℃孵育過夜。取出后用含0.05%吐溫20的PBS洗3次，每次10 min，再用3 ml的1 ∶2 000稀釋的相應二抗37 ℃搖床孵育1 h，PBS洗3次，用ECL的試劑盒在暗室中曝光、顯影。使用Image-Pro Plus圖像分析管理軟件對圖像進行灰度掃描，以特異性條帶平均光密度與面積的乘積為有效值，反應蛋白表達水平。

2 結果

2.1 SDF對IHF大鼠肝臟組織形態(tài)學的影響HE染色結果顯示，正常對照組大鼠肝臟中肝小葉結構清晰，肝細胞索由中央靜脈向四周放射狀排列，無脂肪變性及壞死。其中僅有少量膠原合成聚集于肝門束并無過度膠原纖維增生。與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟中肝小葉正常結構被破壞或消失，少量肝細胞壞死，匯管區(qū)可見大量網(wǎng)狀纖維及膠原纖維增生，纖維間隔增厚，肝細胞索排列紊亂，部分可見假小葉形成(P<0.01)。與模型組比較，SDF高、中劑量組及陽性組可以明顯減輕模型大鼠的HF程度(P<0.01)，SDF低劑量組改善情況不明顯(P>0.05)，見圖1、表2。

圖1 SDF對IHF大鼠肝臟組織形態(tài)學的影響 HE×400

A：正常對照組；B：模型組；C：陽性組；D：SDF低劑量組；E：SDF中劑量組；F：SDF高劑量組

表2 SDF對IHF大鼠HF程度的影響

與正常對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.2 SDF對IHF大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和CⅣ含量的影響實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN及CⅣ的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，陽性組以及SDF高、中劑量組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN及CⅣ的含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SDF低劑量組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN及CⅣ的含量改變不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.3 SDF對IHF大鼠肝組織勻漿中cAMP含量的影響實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織勻漿中cAMP含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，陽性組以及SDF高、中劑量組大鼠肝組織勻漿中cAMP含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；SDF低劑量組大鼠肝組織勻漿中cAMP含量改變不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=80.874，P=0.000)，見圖2。

圖2 SDF對IHF大鼠肝組織勻漿中cAMP含量的影響

1：正常對照組；2：模型組；3：陽性組；4：SDF低劑量組；5：SDF中劑量組；6：SDF高劑量組；與正常對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

表3 SDF對IHF大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和CⅣ含量的影響

與正常對照組比較:**P<0.01；與模型組比較:#P<0.05，##P<0.01

2.4 SDF對IHF大鼠肝組織中TGF-β1蛋白表達的影響將各組大鼠肝組織勻漿中總蛋白提取出，以β-actin為內參蛋白，用圖像分析軟件進行圖像處理，計算各組大鼠肝組織勻漿中TGF-β1/β-actin的比值，并以正常對照組為基數(shù)1，計算各組比值的相對比例。實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織勻漿中TGF-β1蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，陽性組以及SDF高、中劑量組大鼠肝組織勻漿中TGF-β1蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；SDF低劑量組大鼠肝組織勻漿中TGF-β1蛋白表達改變不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 SDF對IHF大鼠肝組織中TGF-β1蛋白表達的影響

1：正常對照組；2：模型組；3：陽性組；4：SDF高劑量組；5：SDF中劑量組；6：SDF低劑量組；與正常對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

3 討論

HF主要是由于病毒、化學毒物或藥物以及遺傳和代謝等疾病共同引起的肝臟炎癥和損傷，其會引起肝臟中纖維組織的廣泛增生，最終導致肝硬化的發(fā)生，而在此過程中，其病理改變是可以被逆轉的，故早期診斷及給予有效治療能夠減緩或防止HF進展為肝硬化以致肝癌[7]。目前研究HF的動物模型主要包括化學藥物或毒物、慢性酒精中毒致HF以及異種血清致IHF等幾種，而IHF模型與其它模型相比較更加接近于人類HF發(fā)病的病理過程，其主要為模擬人體內免疫復合物所致的Ⅲ型過敏反應，與臨床上病毒性肝炎引起的HF類似，且纖維化形成較穩(wěn)定，對動物整體損傷輕微并有利于進行長期的研究[8-9]，故本次實驗采用豬血清誘導的IHF作為動物模型。

臨床上評估慢性肝病患者病情發(fā)展情況和治療效果主要以患者血清中肝纖四項(HA、PCⅢ、LN、CⅣ)含量的高低作為常用指標[10]。其在血清中的水平可以衡量肝臟中炎癥的活動度以及HF的程度，隨著HF嚴重程度的增加血清中肝纖四項含量逐漸升高，且趨勢具有正相關性[11]。在本實驗中，模型組大鼠血清中肝纖四項含量顯著升高，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而SDF高、中劑量組能夠降低模型大鼠血清中肝纖四項的含量，差異有統(tǒng)計學意義，提示SDF能夠有效改善IHF大鼠的HF程度。

目前研究顯示，HF發(fā)病的分子病理生理學機制主要是為激活的HSC引起的肝臟中ECM的過渡沉積。HSC起初的激活主要是通過鄰近細胞如竇狀隙內皮細胞、庫普弗細胞(Kupffer cell，KC)、肝細胞等的旁分泌作用引起，而其中內皮細胞及KC細胞能夠通過分泌TGF-β1等細胞因子促使HSC激活并轉化為肌成纖維細胞，使之向損傷部位遷移、增殖并產(chǎn)生Ⅰ、Ⅲ型膠原等ECM，使HF程度不斷加重[12-13]。同時以往的體外實驗[14]也顯示HSC-T6細胞株在TGF-β1的刺激下，細胞膜上抑制型G蛋白表達增加，激活型G蛋白表達降低，胞內的cAMP水平下降，而細胞內的cAMP水平的下降與HSC-T6的增殖與膠原合成密切相關，表明TGF-β1能夠通過抑制G蛋白-AC-cAMP通路降低HSC內的cAMP水平，進而促進HSC的激活。在本實驗中，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織勻漿中TGF-β1蛋白表達明顯升高，cAMP水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而SDF高、中劑量組能夠顯著降低模型大鼠肝臟中TGF-β1蛋白的表達量，同時升高cAMP水平，提示SDF可能通過降低肝臟內TGF-β1蛋白的表達抑制HSC的增殖和ECM的合成及降解達到減輕HF的目的。