ephrinB2基因轉染脫落乳牙來源的牙髓干細胞提高其成骨/成牙本質分化的研究

胡曉燕，朱紹躍，徐建光，李午麗，張 菁

牙齒相關疾病所造成的牙槽骨、牙骨質和牙周膜的破壞是導致成人牙齒喪失的主要原因。從人類乳牙的牙髓組織中分離鑒定出的牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs)具有成骨、成牙本質等多向分化潛能,與其它干細胞相比，乳牙來源的SHEDs是更易于獲得的干細胞來源[1]；研究[2]表明，基因轉染促紅細胞生成素肝細胞激酶受體配體B2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor interacting protein-B2，ephrinB2)能夠誘導間充質干細胞的成骨分化。該研究旨在明確ephrinB2在調控SHEDs成骨分化中的作用，通過使SHEDs過表達ephrinB2來觀察SHEDs中ephrinB2和促紅細胞生成素肝細胞激酶受體B4(erythropoietin-producing hepatocyte B4， EphB4)之間如何通過信號串擾來增加細胞的成骨能力；ephrinB2和EphB4信號通路如何在SHEDs和前成骨細胞的共培養中發揮相互作用以提高成骨活性。

1 材料與方法

1.1 細胞分離與鑒定實驗涉及的所有試劑、細胞及乳牙獲得了安徽醫科大學倫理委員會的同意。將拔除的滯留乳牙在無菌環境下進行牙髓提取， I型膠原蛋白酶和中性蛋白酶消化獲得細胞混懸液。在37 ℃、5% CO2培養箱中，將獲得的細胞在含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基中培養至第3代，流式細胞儀檢測其干細胞特性，檢測STRO-1、CD45、CD73、CD90和CD105表面標志物的表達。然后再分別用各自的誘導培養基做成骨/成牙本質、成脂、成神經分化試驗。分別用2%茜素紅S染色實驗、0.21%油紅O染色實驗以及熒光免疫檢測多向分化能力。

1.2 慢病毒載體轉染細胞轉染病毒購自美國GenTarget公司，將EfnB2-綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)-Bsd(實驗組)或空載體GFP-Bsd(對照組)轉染入SHEDs，具體如下：當細胞增殖達到50%融合時，將EfnB2-GFP-Bsd和GFP-Bsd分別加入培養基中，慢病毒的轉染需要在37 ℃、5% CO2培養箱中維持24 h。篩選穩定的轉染細胞后，將1×105的SHEDs、空載體SHEDs(Vector-SHEDs)、EfnB2-SHEDs種入6孔板中，37 ℃孵育24 h，熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效果。ephrinB2的mRNA和蛋白表達水平用RT-PCR和Western blot分別檢測。

1.3 細胞增殖實驗用CCK-8試劑盒進行細胞增殖實驗，具體如下：將每孔細胞密度為1×104的EfnB2-SHEDs和 Vector-SHEDs懸液種在96孔板中過夜(37 ℃、5% CO2)。分別在第0、2、4、6、8天加入CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2孵育4 h，隨后在酶標儀上檢測，檢測吸收波長為450 nm。根據所測得吸光度(optical density, OD)值計算每組細胞增殖活力。

1.4 細胞遷移實驗分別將每孔細胞密度為1×105的EfnB2-SHEDs和Vector-SHEDs放入24孔板上室培養，分別在第6、8、10、12 小時計數遷移到下室的細胞數。

1.5 成骨誘導將1×104Vector-SHEDs和EfnB2-SHEDs種入24孔板，培養至70%融合時加入成骨誘導培養基培養。12 d后行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)實驗，染色細胞在倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。21 d后，細胞用4%的多聚甲醛固定，2%茜素紅染色以檢測礦化結節，顯微鏡下觀察拍照。用Quantity One 1-D 分析軟件分析ALP和茜素紅染色的強度。

1.6 RT-PCR用RNeasy Mini kit試劑盒提取單獨培養的Vector-SHEDs 和EfnB2-SHEDs的總RNA，并用RNase-Free DNase kit試劑盒純化；隨后，用SuperScript Ⅲ反轉錄酶將1.0 μg的總RNA合成cDNA，并用Nanodrop2000分光光度計來進行定量。用ABI Prism 7000進行RT-PCR，反應條件為95 ℃、10 min；95 ℃、15 s， 58 ℃、1 min，40個循環。成骨標志物ALP、Ⅰ型膠原蛋白(collagen1, COL1)、Runx2、牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)、骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP)和內參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物用引物設計軟件Primer Express設計，RT-PCR的引物序列見表1。

1.7 Western blot將1×105Vector-SHEDs和 EfnB2-SHEDs培養至70%融合度，成骨誘導培養基培養6、12、24 h后裂解離心， BCA試劑盒檢測蛋白濃度，10% SDS-PAGE凝膠電泳轉膜，一抗、二抗孵育。所用抗體：Ephrin B兔抗人多克隆抗體、EphB4抗體購自美國Santa Cruz公司；磷酸化Ephrin B抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG 購自美國Cell Signaling Technology公司；抗β-actin鼠多克隆抗體購自美國Bioworld Tech公司。

1.8 免疫沉淀和免疫共沉淀試驗為分析EphB4的蛋白質磷酸化，將細胞用-20 ℃預冷的含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA細胞裂解液裂解，解凍后樣本二等分，加入20 μl蛋白 G 瓊脂糖珠和1 μg EphB4抗體，4 ℃過夜。正常的兔IgG和鼠IgG用作對照組。免疫沉淀物用RIPA裂解液和PBS洗，100 ℃加熱3 min，10%梯度SDS-PAGE，轉至PVDF膜，5% BSA/TBS/0.5% Tween 20緩沖系統封閉液封閉，加入一抗磷酸化酪氨酸鼠單克隆抗體(4G10)或EphB4兔抗，再分別加入二抗，HRP標記山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG。HRP發光法檢測結果。

表1 人類ALP、 BSP、COL1、 Runx2、 DSPP、 ephrinB2基因RT-PCR引物序列

2 結果

2.1 SHEDs的分化能力檢測流式細胞儀分析顯示：提取的SHEDs高表達CD73、CD90、CD105等干細胞標志物，而CD45為低表達；20.8%的SHEDs表達STRO-1。見圖1A。另外，分離的SHEDs具有多向分化能力：成骨誘導實驗組可見鈣結節形成。見圖1B；成脂誘導實驗組油紅-O染色可見脂滴形成。見圖1C；成神經誘導實驗組可見β-Ⅲ微管蛋白顯著表達。見圖1D。

2.2 ephrinB2轉染SHEDsVector-SHEDs組和EfnB2-SHEDs 組GFP強表達，而在對照組wild-type SHEDs組中則沒有檢測出熒光信號。見圖2A。RT-PCR結果顯示：EfnB2-SHEDs組的ephrinB2 mRNA表達量高于Vector-SHEDs組和wild-type SHEDs 組12倍多(P<0.05)。見圖2B。Western blot分析顯示：EfnB2-SHEDs組中ephrinB2的表達值高于Vector-SHEDs組和wild-type SHEDs組(P<0.05)。見圖2C。

2.3 實驗組與對照組的細胞遷移能力及細胞增殖能力比較與wild-type SHEDs組、Vector-SHEDs組比較，EfnB2-SHEDs組表現出明顯增加的細胞遷移能力(P<0.05)。見圖3A。然而，3組在細胞增殖方面差異無統計學意義(n=6)，見圖3B。

2.4 實驗組與對照組的成骨分化在誘導培養基中，與Vector-SHEDs組比較，EfnB2-SHEDs組顯示出了更高的ALP活性和礦化能力(n=4)。見圖4。

2.5 實驗組和對照組的成骨分化標志物的mRNA表達水平RT-PCR的結果顯示：在成骨誘導培養后7、14、21d，EfnB2-SHEDs組的ALP、BSP、COL1 和 Runx2的mRNA表達水平高于Vector-SHEDs組(P<0.05)，但在14 d和21 d時差異無統計學意義。見圖5E。

圖1 SHEDs的分化能力檢測

A：流式細胞儀分析SHEDs的表面抗原特征表型CD45、CD73、CD90、CD105、STRO-1； B：成骨誘導4周后的茜素紅染色結果；C：成脂誘導3周后油紅O染色結果 ×10；D：成神經誘導2周后免疫熒光結果 ×100

圖2 對照組與實驗組的轉染結果比較

A： wild-type SHEDs組、Vector-SHEDs 組、EfnB2-SHEDs組的GFP表達；B：wild-type SHEDs組、Vector-SHEDs 組、EfnB2-SHEDs組的ephrinB2相對mRNA表達量；C：Western blot分析wild-type SHEDs組、Vector-SHEDs 組、EfnB2-SHEDs組的ephrinB2表達水平；與Wild-type SHEDs、Vector-SHEDs比較：*P<0.05

圖3 wild-type SHEDs組、Vector-SHEDs 組、EfnB2-SHEDs組的細胞遷移和細胞增殖能力比較

A： wild-type SHEDs組、Vector-SHEDs 組、EfnB2-SHEDs組在細胞遷移實驗中的相對細胞數；B：wild-type SHEDs組、Vector-SHEDs 組、EfnB2-SHEDs組在培養后0、2 、4 、6、8 d的相對OD值；與Wild-type SHEDs、Vector-SHEDs比較：*P<0.05

圖4 wild-type SHEDs組、Vector-SHEDs 組和EfnB2-SHEDs組的成骨分化

A、C： wild-type SHEDs組、Vector-SHEDs 組、EfnB2-SHEDs組在培養后14 d時ALP染色及18 d時茜素紅染色； B、D： wild-type SHEDs組、Vector-SHEDs 組和EfnB2-SHEDs組的相對ALP密度和相對礦化結節密度；與Wild-type SHEDs、Vector-SHEDs比較：*P<0.05

圖5 Vector-SHEDs 組、EfnB2-SHEDs 組ALP、BSP、COL1、Runx2和DSPP的相對mRNA表達水平

A：ALP；B：BSP；C：COL1；D：Runx2；E：DSPP；與Vector-SHEDs比較：*P<0.05(P<0.05)。見圖5A～D。 EfnB2-SHEDs 組DSPP 的mRNA表達在7 d時高于Vector-SHEDs組

2.6 實驗組和對照組EphrinB2/EphB4的蛋白質磷酸化當用EphB4-Fc來刺激Vector-SHEDs組和 EfnB2-SHEDs組時，EfnB2- SHEDs組比Vector-SHEDs組表現出更高的磷酸化水平。見圖6A。當EfnB2-SHEDs組和Vector-SHEDs組在成骨誘導培養基中培養時，ephrinB2的磷酸化水平在6 h時開始升高，12 h時達到最高。見圖6B。EfnB2-SHEDs組在12 h發生EphB4酪氨酸磷酸化，24 h達到最高值。見圖6C。在12 h和24 h，免疫共沉淀試驗證實ephrinB2 與 EphB4之間發生了直接反應。見圖 6D。

圖6 Vector-SHEDs組和EfnB2-SHEDs組ephrinB2 和EphB4的蛋白質磷酸化

A：EphB4-Fc的刺激使EfnB2-SHEDs組表現出更高的磷酸化水平；B：成骨誘導培養基中的ephrinB2磷酸化在12 h時達高峰；C： Vector-SHEDs組和 EfnB2-SHEDs組在成骨培養基中的EphB4蛋白磷酸化；D：免疫共沉淀顯示成骨培養基中Vector-SHEDs組和EfnB2-SHEDs組12 h和24 h時不同的ephrinB2表達水平

3 討論

當牙齒或者牙槽骨受到損傷或破壞后，牙齒或牙槽骨能夠通過干細胞、生物支架及活性因子之間的相互作用來完成對損傷的修復[3]。通過移植基因轉染的干細胞將形態發生因子、生長因子和抗炎因子等輸送到目的位點的方法為組織修復與再生提供了新的思路[4-5]。基因轉染ephrinB2能夠誘導間充質干細胞的成骨分化[2]，成牙本質細胞系和成骨細胞系密切相關，SHEDs也是間充質干細胞的一個亞型，因此，ephrinB2及其同源受體EphB4、EphB2可能在SHEDs的成骨/成牙本質分化中發揮了相似的作用。

間充質干細胞、成骨細胞和SHEDs表面都表達EphB4 受體及其同源配體。本研究通過基因轉染技術上調SHEDs自身的EfnB2表達水平，結果顯示不論是基因水平還是蛋白水平，ephrinB2基因轉染SHEDs (EfnB2-SHEDs)表現出顯著的ephrinB2表達上調。與Vector-SHEDs組比較，EfnB2-SHEDs組表現出更強的遷移能力。另外，在成骨誘導條件下培養時，EfnB2-SHEDs組能形成更多的礦化結節并展現出明顯增加的多種成骨基因(包括ALP、COL1、RunX2、BSP和DSPP)的表達。

本研究進一步探討了ephrinB2與其同源配體之間的作用機制。首先，對SHEDs進行了21 d的成骨/成牙本質誘導培養，然后檢測其ephrinB2、EphB2、EphB4內源性表達水平的變化。RT-PCR結果顯示，在誘導培養過程中，EphrinB2及其同源受體EphB2和EphB4的表達水平有顯著的改變，并且這一結論也被Western blot 結果所佐證。這就證實了這些細胞表面受體分子的確在SHEDs的成骨/成牙本質分化過程中發揮了作用。其次用EphB4-Fc重組蛋白來刺激Vector-SHEDs組和 EfnB2-SHEDs組時，EfnB2-SHEDs組比Vector-SHEDs組表現出更高的磷酸化水平。當EfnB2-SHEDs組和Vector-SHEDs組在成骨誘導培養基中培養時，ephrinB2的磷酸化水平在6 h時開始升高，12 h時達到最高。EfnB2-SHEDs組在12 h發生EphB4酪氨酸磷酸化，24 h達到最高值。12 h和24 h的免疫共沉淀試驗顯示ephrinB2與EphB4發生了相互作用，同時出現了正向和反向信號傳導[6]。ephrinB2 反向信號在骨重建中發揮了很多的關鍵作用，比如：通過與破骨細胞前體細胞中的核因子κB受體活化因子相互作用來調控核因子κB受體活化因子配體的表達以促進骨吸收和破骨細胞形成；通過抑制成骨細胞凋亡來促進成骨細胞的持續分化；以及維持成骨細胞和骨細胞蛋白的表達以調控新形成的骨基質的礦化[6]。盡管在SHEDs中的ephrinB2反向信號途徑還不清楚，但是ephrinB2與EphB4 、EphB2對鄰近細胞的相互作用最終激活了EphB4、EphB2的正向信號途徑，從而促進了成骨分化[6-7]。本研究中，ephrinB2在SHEDs中的過表達并沒有促進EphB4的過表達，而是促進了EphB4的磷酸化。被ephrinB2觸發的EphB4正向信號途徑導致了成骨細胞中的早期成骨轉錄因子Runx2及其下游目標ALP的Ras-和細胞外信號調節激酶1/2-依賴型的激活[8]。

本研究表明ephrinB2及其同源受體在SHEDs的成骨/成牙本質分化中發揮了重要的作用，ephrinB2/EphB4信號通路參與了SHEDs成骨/成牙本質分化的過程。系統性研究這些表面受體分子在SHEDs成骨/成牙本質分化中的作用將有助于進一步研究活性因子是如何促進SHEDs分化為成骨細胞/成牙本質細胞以完成組織修復的。