缺血預處理誘導的血清外泌體對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

產進中,劉 中,黃 俊,張 麗,張 野,何淑芳

缺血性心臟病是目前全球致死率最高的心血管疾病[1-2]。其中心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷是導致患者死亡的主要原因之一[3]。外泌體(exosome，Exo)是細胞主動向胞外分泌的一種囊泡樣小體，直徑約為30～100 nm，其可通過運輸蛋白質、RNA或微小RNA (microRNA，miRNA)等物質，靶向作用于細胞，是細胞間信號通訊的重要方式之一[4]。研究[5]表明Exo在心血管疾病中可以發揮重要的心肌保護效應。然而，關于Exo是否參與缺血預處理(ischemic preconditioning, IPC)[6]介導的心肌保護效應，目前尚未報道。因此，該研究擬通過探討IPC處理后從血清提取的Exo對心肌I/R損傷的影響，以研究IPC發揮心肌保護作用的新機制和靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料ExoQuickTM外泌體提取試劑盒購自美國SBI公司；2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海碧云天科技研究所；抗白細胞分化抗原(cluster of differentiation，CD 63)、抗熱休克蛋白(heat shock protein，HSP60)抗體均購自美國Santa Cruz公司；ECL發光試劑盒購自美國Pierce公司；氯化三苯基四氮唑(TTC，129K1867V)購自美國Sigma公司；肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)測定試劑盒(化學發光法)購自美國Beckman Coulter公司；HX-300S型動物呼吸機購自成都泰盟科技有限公司；PowerLab系統購自澳大利亞AD公司；冷凍透射電鏡購自中國科技大學生命科學院；Tanon全自動凝膠成像系統購自上海天能科技有公司。

1.2 I/R模型建立清潔級健康雄性SD大鼠38只，體質量250～300 g，由安徽醫科大學動物實驗中心提供。大鼠經腹腔注射5%戊巴比妥50 mg/kg麻醉下，行氣管切開插管，連接動物呼吸機，以室內空氣通氣，潮氣量為20～30 ml/kg，呼吸頻率為70～80次/min。行左頸動脈切開置管，通過壓力換能器，連接PowerLab系統，記錄心電圖、平均動脈血壓(mean artery pressure，MAP)、心率(heart rate，HR)。行右頸內靜脈切開置管用于輸液和給藥。沿左鎖骨中線切開皮膚2 cm，在第4、5肋間打開胸腔，剪開心包，輕壓右側胸廓，擠出心臟。在肺動脈圓錐與左心耳之間冠狀動脈處用6-0 Prolene線作一線結，把心臟放回胸腔，穩定15 min后開始缺血再灌注損傷實驗，即收緊線結即完成左冠狀動脈閉塞致心肌缺血，表現為其支配的局部心肌發紺、血壓下降、ST段抬高或降低；松開線結即行再灌注處理。

1.3 Exo的分離提取取8只大鼠隨機分為2組(n=4)：IPC組，先進行IPC，即對心肌行缺血5 min，再灌注5 min，重復3次。處理結束即刻經頸動脈快速取血置于含促凝劑的采血試管內，獲取血清，利用ExoQuickTM試劑盒提取Exo，加入100 μl PBS重懸，經0.22 μm的無菌濾膜除菌，于-80 ℃保存，標記為缺血預處理外泌體(Exo-IPC)。對照組(CON)，僅穿線不進行任何處理，30 min后獲取血清，然后以相同方法提取外泌體，標記為對照外泌體(Exo-CON)。

1.4 Exo鑒定分析將10 μl混懸均勻的Exo溶液滴在載樣銅網上，室溫靜置1 min后，液體用濾紙從銅網邊緣吸去。用10 g/L磷鎢酸(pH 6.8)滴于銅網上，室溫負染5 min，濾紙從銅網邊緣吸去多余液體，待常溫下干燥后，80～120 kv上機成像。用冷凍透射電鏡觀察外泌體的形態，并隨機選取視野，拍攝照片，用標尺計算直徑。冰上解凍外泌體，加入5×上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min使蛋白變性，常規制膠、上樣，蛋白電泳，然后轉膜、封閉，分別加入5% BSA稀釋的一抗HSP60(1 ∶500)或CD63(1 ∶500)，4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗滌3次，每次10 min，在山羊抗鼠IgG(1 ∶10 000)或山羊抗兔IgG(1 ∶20 000)中室溫孵育1 h，TBST液漂洗3次，每次5 min，采用ECL發光試劑盒，在Tanon全自動凝膠成像系統中自動曝光采集圖像。

1.5 Exo濃度測定參照文獻[7]方法，將提取的Exo樣品利用2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白定量法測定提取Exo濃度。分別取待測Exo-IPC、Exo-CON樣品各5 μl稀釋10倍后，嚴格按照BCA試劑盒的說明書測量各樣品的濃度，每個樣品設3個復孔。

1.6 實驗動物分組及給藥方法大鼠采用隨機數字表法分為5組(n=6)：假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、I/R+Exo-IPC組、I/R+Exo-CON組、溶劑對照組(I/R+PBS組)。I/R+Exo-IPC組、I/R+Exo-CON組、I/R+PBS組分別于缺血前15 min經頸靜脈一次性給予Exo-IPC(0.4 μg/μl)、Exo-CON(0.4 μg/μl)以及PBS各100 μl。除Sham組外，其余各組均給予缺血30 min，再灌注120 min處理。

1.7 血清肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)測定于再灌注120 min結束后，經頸動脈取血，離心分離血清，放入-80 ℃保存。嚴格按照cTnI測定試劑盒(化學發光法)要求測定各組血清cTnI水平。

1.8 心肌梗死體積測定實驗結束后取出心臟，去除非心臟組織，生理鹽水灌注，沖洗出血液，結扎左冠狀動脈，從主動脈注入0.25% Evan藍溶液。置于-80 ℃冰箱中，待充分冷凍后，行冰凍切片，沿心臟縱軸線切5～6片，每片厚約2 mm。切片放于1%氯化三苯基四氮唑溶液中，37 ℃水浴鍋中孵育15 min；隨后用10%中性福爾馬林固定過夜，缺血危險區中呈白色為梗死區，呈紅色為非梗死區。采用Imaging J 1.38e圖像分析軟件分析左心室(left ventricular area，LV)、右心室(right ventricular area，RV)、缺血危險區(area at risk，AAR)和梗死區(infarct size，IS)的面積，乘以0.2 cm即為各區的體積，并計算LV體積與RV體積之和(LV+RV)、IS體積與AAR體積以及IS/ARR比值。

2 結果

2.1 Exo的鑒定分析通過透射電鏡觀察納米級別的Exo形態，可見大小均一的微型囊體結構，直徑約30～100 nm左右，形態為圓形或橢圓形，在邊緣可觀察到類似細胞膜的雙層膜結構，見圖1。Western blot 結果顯示：Exo-IPC的Exo特異性蛋白標志物HSP60(t=4.009，P<0.05)和CD63(t=3.905，P<0.05)的相對表達量增高，差異有統計學意義，見圖2A、2B 。BCA法測定血清Exo濃度，結果顯示：Exo-IPC中Exo濃度顯著增多，差異有統計學意義(t=3.066，P<0.05)，見圖2C。

2.2 心肌梗死體積各組LV+RV體積及AAR體積差異均無統計學意義(P>0.05)；與Sham組比較，其余各組的IS體積和IS/AAR比值均升高，差異有統計學意義(F=53.28，P<0.01)；與I/R組比較，I/R+Exo-IPC組的IS體積和IS/AAR比值顯著降低，差異有統計學意義(t=3.209，P<0.05)；與I/R組比較，I/R+Exo-CON組、I/R+PBS組的IS體積和IS/AAR比值差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖1 外泌體透射電鏡觀察形態學結果A：bar=200 nm;B:bar=100 nm

圖2 Western blot 檢測外泌體表面蛋白標志物以及BCA法測定外泌體濃度

A、B：HSP60、CD63表達；C：外泌體濃度；與Exo-CON比較：*P<0.05

2.3 cTnI水平與Sham組比較，其余各組再灌注120 min時血清cTnI濃度均升高，差異有統計學意義(F=27.14，P<0.01)；與I/R組比較，I/R+Exo-IPC組血清cTnI濃度降低，差異有統計學意義(t=7.013，P<0.05)；與I/R組比較，I/R+Exo-CON組、I/R+PBS組血清cTnI濃度差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清cTnI水平的比較

與Sham組比較：*P<0.01；與IR組比較：#P<0.05

3 討論

臨床上心肌梗死溶栓、冠脈搭橋術和心臟瓣膜置換術等治療方法都會涉及心肌I/R損傷這一重要的病理生理過程，預防和減輕心肌I/R損傷是目前臨床上急需解決的問題。Exo作為細胞主動向胞外釋放的具有一定生物活性功能的小囊泡，在心肌缺血后信號轉導和組織修復過程中可能發揮著重要作用[8]。本研究通過提取IPC處理后大鼠血清中的Exo，將其注入受體大鼠體內，證明這些Exo可減輕受體大鼠心肌I/R損傷，降低心肌梗死面積和cTnI水平，提示預處理誘導釋放的內源性Exo可能成為促進心肌缺血后組織損傷修復的潛在治療措施。

本研究參照文獻[9]利用ExoQuickTM試劑盒提取大鼠血清中的Exo。根據文獻[10]報道，電鏡下Exo為直徑介于30～100 nm之間的類似橢圓形結構的納米級雙層膜囊泡，本研究在透射電鏡下觀察到的結果與其相符合。CD63、HSP60是目前鑒定Exo主要的表面標志性蛋白[11-12]，本研究采用Western blot檢測顯示提取的外泌體CD63、HSP60均為陽性表達，且Exo-IPC中外泌體特異性的蛋白標志物相對表達量增高。同時，本研究還顯示經過IPC后，大鼠血清Exo的濃度明顯增加，表明IPC可刺激機體大量釋放內源性Exo，從而增加其在血清內的含量。有報道[13]顯示，當機體處于應激狀態下時，細胞會迅速增加Exo的分泌量并改變其內容物的成分，并對機體產生不同程度的影響。Vicencio et al[11]研究顯示，對自愿者和大鼠分別進行遠端缺血預處理同樣顯著地增加了兩者血漿中Exo的水平。

圖3 TTC染色法檢測各組大鼠心肌梗死

在心肌I/R損傷前，本研究將IPC誘導釋放的血清Exo注入大鼠靜脈內，可明顯減小心肌梗死面積，同時血清cTnI水平也相應地降低，然而對照組Exo對I/R損傷不產生保護效應，這一結果提示IPC可通過刺激機體釋放具有保護性作用的內源性Exo途徑，來減輕缺血和再灌注引起的心肌損傷。Exo在預處理介導的心肌保護效應中發揮何種作用及其相關機制，目前國內外研究還很少。Giricz et al[12]報道，離體灌流的供體心臟經過3次(每次5 min)的IPC處理后，其冠脈流出液中的細胞外囊泡(其中包含有Exo)，有助于減輕受體心臟的I/R損傷。遠端缺血預處理誘導的內源性外泌體可能通過轉運HSP70蛋白，激活心肌細胞內細胞外調節蛋白激酶和p38通路發揮心肌保護作用[11]。最新研究[14-15]還證實，經過缺氧預處理的間充質干細胞所分泌的Exo中含有大量的miRNA-22和miRNA-221，可通過作用于心肌細胞凋亡調控因子而發揮抗細胞凋亡作用。本研究通過IPC誘導機體釋放Exo，研究內源性Exo心肌保護中的作用，但其具體作用機制尚需進一步研究。

綜上所述，IPC可誘導大鼠血清Exo釋放增加，這種內源性的Exo可減輕受體大鼠心肌I/R損傷，為研究IPC的心肌保護機制提供了新的方向以及的理論依據。