地塞米松對小鼠骨細胞白細胞介素-6及核因子κB受體活化因子配體表達的影響

鄭 韻，余 科，李 昶

地塞米松是糖皮質激素的一種，能發揮抗炎和免疫抑制作用，低濃度(10-7～10-9mol/L)地塞米松作用于成骨細胞還產生誘導成骨的作用[1]。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是種植體周圍炎主要致病因素，誘導成骨細胞產生促炎因子白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)[2]，還能上調核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)，使RANKL/骨保護素(osteoprotegerin，OPG)比率下降[3]從而引發骨破壞。地塞米松則對LPS誘導的成骨細胞IL-6有抑制作用，但目前為止有關不同濃度地塞米松對骨細胞的作用鮮有報導。該研究以小鼠骨細胞MLO-Y4為研究對象，以骨改建的重要調節因子IL-6和骨破壞過程中的重要信號通路RANKL為檢測指標，探討地塞米松是否能影響骨細胞IL-6及RANKL的表達，對LPS刺激下骨細胞上調的IL-6及RANKL如何作用。旨在獲得一種減少種植體周圍炎骨吸收的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要材料和試劑 MLO-Y4骨細胞株[由Dr.Lynda F.bonewald(美國密蘇里州堪薩斯大學口腔生物系)惠贈]；α-MEM培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自中國四季青公司；LPS(E.coli0111B4)、地塞米松購自美國Sigma-Aldrich公司；CCK-8試劑購自日本同仁公司；RNA提取試劑盒購自中國TIANGEN公司 ；Rever Tra Ace?qPCR Master Mix購自日本TOYOBO公司；2×SG Fast qPCR Master Mix購自中國BBI Life Sciences公司；小鼠IL-6檢測試劑盒購自中國橋杜公司；實時熒光定量PCR所用引物由上海生工生物工程公司合成。

1.1.2主要儀器 CO2培養箱(型號：MCO-15AC)購自日本SANYO公司；生物安全柜(型號：BSC-1300IIA2)購自中國蘇凈安泰公司；吸光度測定儀(型號：Varioscan)購自美國Thermo公司；實時熒光定量PCR儀(型號：Step One Plus)購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1骨細胞培養 復蘇后用含89% α-MEM培養基、10%胎牛血清和1%雙抗的培養基培養、增殖和傳代。

1.2.2CCK8細胞毒性檢測 將MLO-Y4細胞以5×104/ml濃度接種于96孔板，每孔加入細胞懸液200 μl，實驗組和對照組分別做4個復孔。待細胞貼壁后吸去原有培養基，于實驗組分別加入地塞米松終濃度為10-6、10-7mol/L的培養基，對照組僅加入新鮮培養基。分別培養24、48、72 h后去除原有培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次后重新加入培養基100 μl。同時設置4個不含細胞、僅有培養基的空白對照孔，加入培養基100 μl，分別在實驗組、對照組和空白對照組孔中加入10 μl CCK8溶液，繼續培養1 h，用吸光度測定儀在450 nm波長處測定吸光度(A)值，取每組4孔平均值為該組樣本檢測值。重復實驗3次，進行統計分析。

1.2.3實時熒光定量PCR

1.2.3.1檢測不同濃度地塞米松對MLO-Y4細胞IL-6和RANKL表達的影響 分別以地塞米松終濃度為0、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L的培養基作用于細胞4 h后，用TRIzol加離心柱法提取細胞總RNA，反轉錄后以實時熒光定量PCR檢測IL-6及RANKL的相對表達量，重復3次，進行統計分析。

1.2.3.2檢測地塞米松在不同時間點對MLO-Y4細胞IL-6和RANKL表達的影響 以地塞米松終濃度為10-7mol/L的培養基作用于細胞，分別于孵箱培養0.5、1、2、3、4、5、6、8 h，每個時間點設置1個對照組。用TRIzol加離心柱法提取細胞總RNA，反轉錄以后用實時熒光定量PCR檢測IL-6及RANKL的相對表達量，重復3次，進行統計分析。

1.2.3.3檢測地塞米松及LPS在不同時間點對MLO-Y4細胞IL-6和RANKL表達的影響 以地塞米松終濃度為10-7mol/L及LPS終濃度為100 μg/L的培養基共同作用于細胞，分別于孵箱培養0.5、1、2、4、6、8、10、12 h后用TRIzol加離心柱法提取細胞總RNA，反轉錄以后用實時熒光定量PCR檢測IL-6及RANKL的相對表達量，重復3次，進行統計分析。

選取GADPH作為內參基因。目標基因和內參基因引物序列見表1，每個樣本做3個復孔取均值。

表1 目的基因引物序列

1.2.4ELISA

1.2.4.1檢測不同濃度地塞米松對MLO-Y4細胞IL-6分泌的影響 分別以地塞米松終濃度為0、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L的培養基作用于細胞4 h，收集細胞上清液后檢測。

1.2.4.2檢測地塞米松在不同時間點對MLO-Y4細胞IL-6分泌的影響 以地塞米松終濃度為10-7mol/L的培養基誘導細胞，分別培養0.5、2、4、8 h，每個時間點另設置1個對照組，僅加入培養基；收集細胞上清液后檢測。

1.2.4.3檢測地塞米松及LPS在不同時間點對MLO-Y4細胞IL-6分泌的影響 以地塞米松終濃度為10-7mol/L及LPS終濃度為100 μg/L的培養基共同誘導細胞，分別培養0.5、4、8、12 h，每個時間點另設置1個對照組，僅加入LPS終濃度為100 μg/L的培養基；收集細胞上清液后檢測。

將上清液以1 000 r/min離心10 min以去除沉淀和細胞碎片。根據說明書用ELISA試劑盒測定IL-6的濃度。每個樣品均設3個復孔，用吸光度測定儀在450 nm處讀取A值。以標準品濃度由低到高為橫坐標，A值為縱坐標繪制標準曲線，計算出標準曲線的回歸方程，代入方程計算濃度。

2 結果

2.1 地塞米松細胞毒性實驗結果10-6mol/L的地塞米松在72 h時對MLO-Y4細胞增殖有影響，而10-7mol/L的地塞米松則對MLO-Y4細胞的增殖無明顯影響。見表2。

表2 地塞米松刺激MLO-Y4細胞各時間點吸光度值

與對照組比較：*P<0.05

2.2 不同濃度地塞米松對MLO-Y4細胞IL-6、RANKL表達及IL-6蛋白分泌的影響地塞米松濃度對MLO-Y4細胞表達IL-6有影響(F=26.844，P<0.001)。兩兩比較得出，10-9mol/L地塞米松對細胞表達IL-6無明顯影響，10-6、10-7、10-8mol/L地塞米松對MLO-Y4細胞表達IL-6有影響，且在10-6、10-7mol/L時最顯著。不同濃度地塞米松對MLO-Y4表達RANKL無明顯影響(圖1)。ELISA結果表明IL-6蛋白分泌與mRNA檢測結果相符(圖2)。

圖1 不同濃度地塞米松作用MLO-Y4細胞IL-6及RANKL mRNA相對表達量

圖2 不同濃度地塞米松作用MLO-Y4細胞IL-6蛋白分泌變化

2.3 地塞米松在不同時間對MLO-Y4細胞IL-6、RANKL表達及IL-6蛋白分泌的影響10-7mol/L地塞米松在0.5 h時對IL-6表達無影響，而其余時間點均下調IL-6表達(P<0.05)，其中4 h時對IL-6表達的下調達峰值。所有時間點對RANKL表達無影響(圖3)；ELISA結果表明IL-6蛋白分泌與mRNA檢測結果相符(圖4)。

圖3 地塞米松對MLO-Y4細胞IL-6及RANKL mRNA表達影響隨時間的變化

圖4 地塞米松對MLO-Y4細胞IL-6分泌的影響隨時間的變化

2.4 地塞米松及LPS在不同時間點對MLO-Y4細胞IL-6、RANKL表達及IL-6分泌的影響相較僅加入100 μg/L LPS的對照組，100 μg/L的LPS和10-7mol/L地塞米松共同作用于骨細胞時，在0.5 h及1 h處對IL-6表達沒有明顯影響，其余時間點地塞米松均對LPS有抑制作用(P<0.05)，且在8 h時這種抑制作用達到峰值(圖5)；ELISA結果表明IL-6蛋白分泌與mRNA檢測結果相符(圖6)。

3 討論

糖皮質激素被證實具有廣泛的抗炎和免疫抑制作用，能下調血清中IL-6和RANKL的表達[4]。地塞米松是糖皮質激素的一種。在成骨細胞研究中，其能抑制IL-6表達，并抑制IL-6對RANKL的上調作用。同時，低劑量(10-7～10-9mol/L)地塞米松能增加成骨細胞ALP和磷酸化GSK-3β蛋白的表達[5]，因此就成骨細胞而言，在種植體周圍炎導致骨吸收傾向時，一定濃度范圍的地塞米松能抑制炎癥，減少破骨，并促進成骨。

圖5 地塞米松及LPS對MLO-Y4細胞IL-6和RANKL mRNA表達影響隨時間的變化

圖6 地塞米松及LPS不同作用時間下MLO-Y4細胞IL-6蛋白分泌變化

骨細胞是由成骨細胞分化而來、位于礦化基質中的星狀細胞，在骨組織細胞中占比高達95%。傳統觀點認為其是“休眠的”、“無功能的”成骨細胞。但現在認為骨細胞有其特殊的生物學特性，并與成骨樣細胞有明顯差異。骨細胞是骨中重要的機械感受性細胞，在調節骨形成和再吸收方面起主要作用[6]，還能接受化學信號，產生多種細胞因子作用于成骨細胞和破骨細胞，調控骨改建。

LPS是細菌內毒素的主要成分，是種植體周圍炎的主要致病因素，有研究[7]表明LPS能上調RANKL，下調OPG，從而刺激破骨細胞形成和骨吸收的產生。在LPS誘導下，種植體周圍組織破壞比牙周組織破壞更快[8]。

IL-6是一種具有多種功能的致炎因子。能在多種細胞中激活有關增殖、分化、存活與凋亡的靶基因。IL-6在骨改建中起重要作用，對成骨細胞分化有負面影響[9]。骨細胞也能產生IL-6，隨之通過調節骨細胞和成骨細胞間通訊來影響骨量[10]。IL-6還能刺激RANKL生成，RANKL是一種能調節多種生理或病理功能的細胞因子，包括破骨細胞分化和骨質疏松癥等[11]。前期研究[12]表明以LPS刺激骨細胞MLO-Y4可明顯促進IL-6和RANKL水平的增加，但對OPG的表達無明顯影響。故若能控制LPS刺激下IL-6和RANKL的分泌，可從分子水平減少二者對種植體周圍炎骨吸收的促進。

本實驗研究顯示，10-6mol/L地塞米松影響骨細胞增殖，但10-7mol/L則無明顯影響。證明對MLO-Y4細胞而言，一定濃度地塞米松對其增殖無明顯影響，但隨著濃度增大，增殖下降，表明地塞米松濃度過大對細胞有抑制甚至毒性作用，使骨細胞存活能力降低，從而導致凋亡。這與Jia et al[13]的結果一致。

不同濃度地塞米松作用于骨細胞時，當濃度為10-8mol/L及以上，與對照組比較，IL-6表達均明顯下降，濃度為10-7mol/L及10-6mol/L時下調最明顯，兩種濃度作用之間無明顯差異。這表明除10-9mol/L濃度以外，其余濃度地塞米松均可下調骨細胞IL-6的表達。在選取下調最明顯、且不影響骨細胞增殖的10-7mol/L濃度作用骨細胞時，不同作用時間下，除0.5 h以外，其余時間點與相同處理時間的對照組相比，IL-6表達均有明顯降低，且在4 h時降低最為明顯，表明地塞米松對骨細胞IL-6分泌產生影響，并有劑量和時間依賴性的抑制作用。當LPS刺激存在時，10-7mol/L地塞米松在除0.5 h和1 h以外的其他時間點中，與相同處理時間的對照組相比，IL-6表達均有明顯降低，且在8 h時最為明顯，說明地塞米松對LPS作用下IL-6的上調有抑制作用，并在8 h時達到峰值。表明地塞米松在炎癥因素(LPS)刺激下能以時間依賴性的方式使骨細胞抗炎反應減弱，減少因LPS上調IL-6而導致的骨吸收。

本實驗中地塞米松刺激對于骨細胞RANKL的表達無明顯影響，表明地塞米松無法抑制LPS對骨細胞RANKL的上調作用，可能是因為骨細胞在LPS刺激下RANKL表達增加與IL-6的促進作用無明顯關聯，LPS對RANKL的上調可能是通過其他途徑實現。要得到能夠明顯抑制RANKL產生的藥物，還需要進一步實驗研究。