IL-6過表達慢病毒穩轉細胞系構建及其對HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達影響

潘正蘭，管世鶴，陳禮文，楊 凱，張 浩，段元麗，王兆飛 ,王 秀，侯舒文

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一種致肝性、非致病性DNA病毒，可以引起急性或慢性肝臟炎癥[1]。其感染呈全球性分布，據世界衛生組織報道，全球約2.5億～4億人曾感染HBV，每年約100萬人死于HBV感染相關疾病[2]。白介素6(interleukin-6,IL-6)是一種典型的細胞因子，由184個氨基酸組成，基因位于7p21染色上[3]，具有多種生物學功能。已有研究證實HBV感染患者中IL-6水平明顯升高[4]，上調的IL-6表達進一步激活相應的炎癥或腫瘤相關信號通路，促進慢性乙型肝炎進展為肝硬化或肝癌[5]。IL-6在HBV感染過程中扮演重要作用。然而，IL-6對HBV復制作用至今未明確。該實驗成功構建IL-6慢病毒表達載體，建立穩定過表達IL-6的細胞系，同時培養Huh7、HepG2 細胞，并進行pcDNA1.3質粒轉染，探討IL-6 對乙肝表面抗原(hepatits B surface antigen，HBsAg)、乙肝e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)、乙肝病毒DNA(HBV-DNA)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料人胚腎293T細胞、人肝癌細胞Huh7、人肝胚瘤細胞HepG2購自上海細胞所；pcDNA1.3質粒為本實驗室所保存；pMIGR1載體質粒及包裝質粒pCL-10A1由中國科學技術大學生命科學院提供；DMEM高糖培養基、限制性內切酶BglⅡ、EcoRⅠ、總RNA提取試劑TRIzol、反轉錄試劑盒、Lipofectamine 2000、Polybrene均購自美國Thermo公司；T4 DNA連接酶購自美國NOVA公司；DNA Marker購自北京康為世紀生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自美國Axygen公司；基因組提取試劑盒購自北京天根生物有限公司；青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司；引物合成及測序由中國通用生物公司完成；胎牛血清購自杭州四季青公司；IL-6電化學發光試劑盒購自羅氏診斷產品(上海)有限公司；Human IL-6(96-200-06-20)購自美國PeproTech公司；HBsAg定量測定試劑盒(化學發光微粒子免疫檢測法)、HBeAg定量測定試劑盒(化學發光微粒子免疫檢測法)購自雅培貿易(上海)有限公司；HBV核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自上海復星長征醫學科學有限公司。

1.2 方法

1.2.1IL-6基因獲取及擴增 參照NCBI中IL-6 mRNA的CDS序列設計引物，上游引物序列為：5′-GAAGATCTAGGAGCCCAGCTATGAACTC-3′，下游引物序列為：5′-CGGAATTCCTACATTTGCCGAAGAGCCC-3′，下滑線的部分分別為Bgl II和EcoR I的酶切位點，全長約500 bp,以Huh7細胞基因組DNA(gDNA)為模板擴增IL-6基因，反應條件為：95 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,57～64 ℃溫度梯度退火30 s,72 ℃延伸90 s,34個循環，最后72 ℃延伸10 min,擴增片段經瓊脂糖凝膠電泳并清潔回收。

1.2.2pMIGR1-IL-6質粒的構建、擴增及鑒定 使用Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ內切酶37 ℃水浴酶切目的基因IL-6和pMIGR1載體6～8 h，DNA連接酶在連接緩沖液中22 ℃連接30 min,連接后的重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞TOP10,收集轉化的菌液涂平板，37 ℃培養箱過夜，次日挑選陽性菌落搖菌，送生物公司測序鑒定，測序正確后中抽試劑盒抽提質粒，獲取pMIGR1-IL-6質粒。

1.2.3重組慢病毒及陰性對照慢病毒的包裝、轉染及濃縮 將生長狀態良好的293T細胞胰酶消化，重懸接種于10 cm培養皿中，待細胞密度達到70%時，將重組慢病毒質粒pMIGR1-IL-6和包裝質粒pCL-10A1以及Lipofectamine 2000共轉染至293T細胞中，轉染前將培養基換成不加雙抗的DMEM培養基,轉染后6～8 h換成完全培養基培養。72 h后收集病毒上清液，4 ℃、11 200 r/min超速離心15 min,收集濃縮液-80 ℃保存。用上述相同的方法獲得陰性對照pMIGR1-NC慢病毒質粒。

1.2.4嘌呤霉素篩選濃度的確定 取對數期生長的Huh7細胞，1.5×105/孔密度接種于24孔板，培養24 h后，梯度加入嘌呤霉素，其濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1 mg/L, 37 ℃、5% CO2培養箱培養，篩選10 d后，觀察24孔板細胞死亡情況，以殺死全部細胞的最小濃度為穩定轉染細胞系的最佳篩選濃度。

1.2.5穩定轉染細胞系Huh7的篩選及建立 取對數生長期的Huh7細胞，1×105/孔密度接種于6孔板中，細胞貼壁后分別加入對照組和實驗組的病毒上清液(培養基 ∶病毒上清液=1 ∶1)及5 mg/L的Polybrene，感染48 h后更換為完全培養基，同時加入最佳濃度的嘌呤霉素進行篩選，15～20 d后，病毒感染組均可見抗性細胞存活，未轉染組細胞全部死亡。挑取抗藥性細胞，擴大培養，2～3周后獲得穩定轉染細胞系。

1.2.6 電化學發光法分析IL-6水平分別收集Huh7/con和Huh7/IL-6細胞培養上清液，按5 000 r/min離心5 min以去除細胞碎片，-80 ℃保存。將上述方法獲得的細胞培養上清液用電化學發光法按試劑盒說明書檢測IL-6水平。

1.2.7實時熒光定量PCR檢測IL-6的mRNA表達水平 嚴格按照TRIzol說明書進行操作，提取細胞總RNA，取2 μg RNA用隨機引物反轉錄合成cDNA，用SYBR Green進行實時熒光定量PCR擴增，以GAPDH為內參，檢測IL-6 mRNA水平的表達量。實驗結果在熒光定量操作系統中進行分析對比，采用2-ΔΔCt對以上數據進行相對定量分析。

1.2.8細胞培養 Huh7細胞、HepG2細胞、Huh7/IL-6穩轉細胞均于37 ℃、5% CO2條件下采用DMEN高糖培養液+10%胎牛血清進行培養，培養液中均含有10 mmol/L HEPES和100 mg/L的氨芐青霉素和鏈霉素。

1.2.9細胞轉染 取對數生長期Huh7細胞、HepG2細胞、Huh7/IL-6細胞進行培養，待細胞密度約為80%融合時按照Lipofectamine 2000說明書進行pcDNA1.3質粒轉染，根據實驗目的進行收樣。

1.2.10電化學發光法分析IL-6水平 分別收集Huh7細胞、HepG2細胞、Huh7/IL-6細胞培養上清液，按5 000 r/min離心5 min以去除細胞碎片，-80 ℃保存。將上述方法獲得的細胞培養上清液用電化學發光法按試劑盒說明書檢測IL-6表達水平。

1.2.11化學發光微粒子免疫檢測法分析細胞培養上清液HBsAg表達水平 分別收集Huh7細胞、HepG2細胞、Huh7/IL-6細胞培養上清液，按5 000 r/min離心5 min以去除細胞碎片，-80 ℃保存。將上述方法獲得的細胞培養上清液用化學發光法按HBsAg定量測定試劑盒(化學發光微粒子免疫檢測法)試劑盒說明書檢測HBsAg表達水平。

1.2.12化學發光微粒子免疫檢測法分析細胞培養上清液HBeAg表達水平 分別收集Huh7細胞、HepG2細胞、Huh7/IL-6細胞培養上清液，按5 000 r/min離心5 min以去除細胞碎片，-80 ℃保存。將上述方法獲得的細胞培養上清液用化學發光法按HBeAg定量測定試劑盒(化學發光微粒子免疫檢測法)試劑盒說明書檢測HBeAg表達水平。

1.2.13PCR-熒光探針法分析細胞培養上清液HBV-DNA表達水平 分別收集Huh7細胞、HepG2細胞、Huh7/IL-6細胞培養上清液，按5 000 r/min離心5 min以去除細胞碎片，-80 ℃保存。將上述方法獲得的細胞培養上清液用化學發光法按HBV核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)試劑盒說明書檢測HBV-DNA表達水平。

1.3 統計學處理采用GraphPad Prism 5進行分析和作圖，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-6目的基因擴增鑒定溫度梯度PCR擴增目的基因，結果顯示條帶位置單一，符合IL-6位置(文獻報道約486 bp)，見圖1。

2.2 MIGR1-IL-6慢病毒載體質粒酶切及測序鑒定目的基因PCR引物序列兩端分別添加BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點序列，PCR技術擴增酶切后，與pMIGR1連接，用限制性內切酶BglⅡ和EcoRⅠ酶切重組質粒，結果顯示目的基因與載體被切開，見圖2A。將酶切結果正確的菌液送公司測序，測序結果完全符合，無突變。表明IL-6慢病毒表達載體構建成功，見圖2B、2C。

圖1 PCR獲得IL-6片段

M：Marker；1～8：57、58、59、60、61、62、63、64 ℃目的基因溫度梯度PCR結果

2.3 電化學發光法檢測Huh7/con和Huh7/IL-6穩轉細胞系上清液中IL-6表達水平使用電化學發光法檢測Huh7/con和Huh7/IL-6細胞上清液中IL-6表達水平，結果顯示Huh7/IL-6細胞上清液中IL-6表達水平較Huh7/con升高約 1 000倍(t=20.760，P<0.000 1)，見圖3。

圖2 pMIGR1載體雙酶切以及pMIGR1與IL-6連接產物測序結果

A：載體質粒雙酶切結果；M：Marker；1：pMIGR1載體原質粒；2：pMIGR載體雙酶切后質粒；B：重組質粒測序結果序列圖；C：重組質粒測序結果峰圖

圖3 電化學發光法檢測Huh7/IL-6細胞上清液中IL-6的表達情況

2.4 qRT-PCR檢測Huh7/con和Huh7/IL-6穩轉細胞系中IL-6的mRNA表達水平采用qRT-PCR檢測Huh7/con和Huh7/IL-6細胞系IL-6 mRNA表達水平，結果顯示Huh7/IL-6細胞系IL-6表達水平較Huh7/con升高約600倍(t=19.780，P<0.000 1)，見圖4。

圖4 qRT-PCR檢測Huh7/IL-6細胞上清液中IL-6的表達情況

2.5 pcDNA1.3質粒轉染不同細胞后不同時間段細胞上清液中IL-6表達水平pcDNA1.3質粒轉染后Huh7細胞上清液中IL-6的表達水平與對照組相比6 h后即出現升高，差異有統計學意義(t=20.260、26.230、30.020、235.900，P<0.000 1)，見圖5A；pcDNA1.3質粒轉染后HepG2細胞上清液中IL-6的表達水平與對照組相比6 h后即出現升高，差異有統計學意義(t=20.520、25.760、34.780、31.490，P<0.000 1)，見圖5B； pcDNA1.3質粒轉染后Huh7/IL-6細胞上清液中IL-6的表達水平與對照組相比6 h后即出現升高，差異有統計學意義(t=16.180、17.170、8.498、9.307，P<0.000 1、P<0.000 1、P=0.001 1、P=0.000 7)，見圖5C。

2.6 IL-6處理pcDNA1.3質粒轉染的Huh7細胞不同時間段細胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達水平20 ng/ml IL-6處理pcDNA1.3質粒轉染后的Huh7細胞，HBsAg的表達水平與對照組相比6 h后即出現下降，12 h后差異開始有統計學意義(t=1.809、3.329、2.781、10.930，P=0.144 7、0.029 1、0.049 8、0.000 4)，見圖6A。HBeAg的表達水平與對照組相比6 h后即出現下降，24 h后差異開始有統計學意義(t=1.375、0.710、2.893、6.557，P=0.241 1、0.517 0、0.044 4、0.002 8)，見圖6B。HBV-DNA的表達水平與對照組相比6 h后即出現下降，48 h后差異開始有統計學意義(t=2.380、0.756、1.053、6.918，P=0.076 0、0.492 0、0.351 8、0.002 3)，見圖6C。

2.7 IL-6處理pcDNA1.3質粒轉染的HepG2細胞不同時間段細胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達水平20 ng/ml IL-6處理pcDNA1.3質粒轉染后的HepG2細胞，HBsAg的表達水平與對照組相比6 h后即出現下降，24 h后差異開始有統計學意義(t=1.107、2.425、4.644、5.021，P=0.330 5、0.072 4、0.009 7、0.007 4)，見圖7A。HBeAg的表達水平與對照組相比6 h后即出現下降，24 h后差異開始有統計學意義(t=1.633、1.203、3.976、5.119，P=0.177 8、0.295 4、0.016 5、0.006 9)，見圖7B。HBV-DNA的表達水平與對照組相比6 h后即出現下降，48 h后差異開始有統計學意義(t=1.788、1.447、1.526、5.054，P=0.148 4、0.221 3、0.201 8、0.007 2)，見圖7C。

圖5 pcDNA1.3質粒轉染Huh7、HepG2、Huh7/IL-6細胞6、12、24、48 h后細胞上清液中IL-6表達水平

圖6 IL-6處理pcDNA1.3質粒轉染的Huh7細胞6、12、24、48 h后細胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達水平

圖7 IL-6處理pcDNA1.3質粒轉染后HepG2細胞6、12、24、48 h后細胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達水平

圖8 pcDNA1.3質粒轉染Huh7/IL-6細胞6、12、24、48 h后細胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達水平

2.8 pcDNA1.3質粒轉染后Huh7/IL-6細胞不同時間段細胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達水平pcDNA1.3質粒轉染后的Huh7/IL-6細胞，HBsAg的表達水平與對照組相比6 h后即出現下降，差異有統計學意義(t=6.949、7.155、3.792、15.300，P=0.002 3、0.002 0、0.019 2、0.000 1), 見圖8A。HBeAg的表達水平與對照組相比6 h后即出現下降，24 h后差異開始有統計學意義(t=2.186、0.500、4.676、12.630，P=0.094 1、0.643 3、0.009 3、0.000 2)，見圖8B。HBV-DNA的表達水平與對照組相比6 h后即出現下降，48 h后差異開始有統計學意義(t=1.155、2.053、2.238、5.652，P=0.312 3、0.109 4、0.088 8、0.004 8)，見圖8C。

3 討論

目前IL-6在HBV感染相關疾病發生發展的功能及機制研究已成為肝臟研究領域的熱點前言。IL-6還被證實與HBV相關肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的預后[6]及治療密切相關[7]。因此，分析IL-6對HBV復制作用對提高HBV感染相關疾病患者的療效具有重要意義[8]。

本實驗以Huh7細胞gDNA為模板，并參照NCBI中IL-6 mRNA的CDS序列設計引物，通過PCR技術擴增獲得IL-6片段并克隆到pMIGR1載體上，經雙酶切及測序驗證正確后進行慢病毒包裝及嘌呤霉素篩選。經電化學發光法及qRT-PCR檢測感染后細胞的IL-6表達量顯著升高。根據以上結果證明，本實驗成功構建IL-6慢病毒表達載體，并建立穩定過表達IL-6的Huh7細胞系，為研究IL-6相關作用及機制打下良好基礎。

IL-6的合成受多種因素控制，據相關報道稱HBV X蛋白(HBX)可以通過增加NF-κB和(或)NF-IL-6與DNA結合上調IL-6轉錄[9]。已有研究[10]表明人肝細胞和肝癌細胞中的HBX表達能激活IL-6基因并刺激IL-6蛋白合成，最近一項研究[11]進一步證實IL-6表達水平隨肝細胞和肝癌細胞中HBX表達增加而增加，進而認為在HBV感染的肝臟微環境中肝實質細胞高表達IL-6[12]。本實驗以人肝癌細胞Huh7、人肝胚瘤細胞HepG2、IL-6過表達細胞Huh7/IL-6為研究模型，通過對其瞬時轉染能夠表達完整病毒子顆粒的質粒pcDNA1.3，結果顯示在3種細胞中IL-6表達水平均顯著升高。證實了HBV感染可以上調肝實質細胞中IL-6表達。

相關研究[13]稱IL-6通過激活某些信號通路，增加HBV增強子1(Enh1)的活性，從而控制HBX的表達和HBV的復制。Xia et al[14]在小鼠中發現IL-6增強肝內HBV復制，同時在人肝胚瘤細胞HepG2中也發現類似作用，進一步發現持續的IL-6刺激可通過磷酸化的STAT3(p-STAT3)-肝細胞核因子-3(HNF-3)復合物與HBV Enh1的相互作用誘導HBV再激活。然而，Chen et al[15]研究卻發現IL-6能夠有效抑制人肝胚瘤細胞HepG2中 HBV復制并阻止HBV共價閉合環狀DNA(cccDNA)的積累。因此，IL-6對HBV復制作用還是有爭議的。機體感染HBV后，病毒在肝細胞中復制并分泌HBsAg、HBeAg、HBV-DNA等標志物，這些標志物水平的降低常被用于評估HBV復制療效的監測指標。本實驗顯示經過IL-6處理后pcDNA1.3轉染的Huh7和HepG2細胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達水平顯著下降，且pcDNA1.3轉染的Huh7/IL-6穩轉細胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達水平也顯著下降。這與Chen et al[15]研究是一致的，說明IL-6抑制HBV復制。然而，IL-6是如何下調HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達及抗HBV機制并未深入研究，仍需進一步闡明。