丹參酮IIA通過抑制NADPH氧化酶保護心衰大鼠心肌纖維化的機制

員小利，井海云，王 丹

丹參酮IIA是從丹參中提取的具有抑菌作用的脂溶性化合物，臨床主要用于預防心絞痛，減少心肌缺血、再灌注損傷，改善冠脈循環，抑制心肌肥厚和抗動脈粥樣硬化等疾病[1-2]。Huo et al[3]通過使用斑馬魚模型對多種抗炎藥物的抗炎性研究發現，丹參酮IIA具有較強的抗炎能力。賀環宇 等[4]研究發現丹參酮IIA可抑制內毒素血癥小鼠的心肌炎癥反應。活性氧(active oxygen，ROS)是細胞在代謝過程中產生的一類不穩定但具有較強活性的O2衍生物。多種病理因素可激活ROS，會使巨噬細胞和嗜中性粒細胞等吞噬細胞對抗急性炎癥反應，但是過量的ROS則會對機體有害[5-6]。NADPH氧化酶(nadph oxidase，NOX)復合物是巨噬細胞和嗜中性粒細胞內ROS產生的主要來源。動物實驗顯示NOX在心肌肥厚、心肌梗死、高血壓病等多種疾病模型中起重要作用[7]。ROS生成增多引起的氧化應激在心肌重構中起重要作用。臨床上使用丹參酮IIA磺酸鈉注射液(sulfotanshinone sodium injection，STS)用于冠心病的治療，在一定程度上可改善患者的心絞痛和心律失常癥狀，同時具有抑制炎癥因子的作用。該研究通過探討參酮IIA對炎癥反應和氧化應激的影響，研究丹參酮IIA改善心肌纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物 健康雄性Wistar大鼠28只，清潔級，6周齡，體質量160～180 g，購自河北省實驗動物中心。

1.1.2主要實驗藥物和設備 丹參酮IIA(北京華夏遠洋科技有限公司)；反轉錄試劑盒(天津眾立生物科技有限公司)；細胞色素(美國Sigma公司)；NADPH(南京碧云天生物技術研究所)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SynergyHT多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1造模方法 參考Anversea方法，在雙腎動脈上方0.5 cm處分離腹主動脈，沿腹主動脈平行放置直徑為0.7 mm的醫用針頭，用絲線繞腹主動脈和針頭一起結扎，隨后抽出針頭，造成腹主動脈狹窄[8]。

1.2.2實驗分組與給藥 28只雌性大鼠自由飲水進食，在(20±2) ℃、明暗各12 h的清潔級動物實驗室內飼養，喂養1周后，隨機分為4組。對照組、丹參酮IIA組只分離腹主動脈，不造成動脈狹窄。造模后次日即開始對各組大鼠進行治療干預，丹參酮IIA組、丹參酮IIA+纖維化組每日上午經腹腔注射給予15 mg/(kg·d)的丹參酮IIA，同時對照組和纖維化模型組大鼠給予腹腔注射等體積的生理鹽水。實驗于第28天終止。

1.2.3樣本采集 觀察各組大鼠的身體情況并做詳細記錄，之后用水合氯醛進行腹腔麻醉，迅速開胸取出心臟，于冰生理鹽水中洗凈，用濾紙吸干，沿房室溝剪掉兩心房，剪掉主肺動脈，將左心室取下，分離后迅速放至液氮中速凍，擬進行病理學檢測的心肌標本置于10%中性福爾馬林溶液中固定，脫水后用石蠟包埋。

1.2.4NADPH氧化酶活性的檢測 心肌NADPH氧化酶活性通過細胞色素C還原實驗測定。裂解組提取組織總蛋白，稀釋至終濃度為1 mg/ml后加入到孔板中(200 μl/孔)，并加入500 μmol/L細胞色素C和1 000 μmol/L NADPH。最后加入或不加入200 U/ml的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，室溫下反應30 min。應用酶標儀在550 nm波長處測定吸光值。根據加入SOD后吸光值的減少量反應NADPH氧化酶活性。

1.2.5心肌SOD含量測定 稱取心肌組織100 mg，加9倍生理鹽水，制成10%勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，再用生理鹽水以1 ∶9稀釋成組織勻漿待測，按說明書步驟測定SOD水平。

1.2.6MDA含量檢測 取心肌組織約100 mg，加入生理鹽水900 μl，利用高通量組織研磨儀獲得組織勻漿，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，利用BCA法測定上清液中蛋白濃度，嚴格按說明書步驟測定MDA水平。

1.2.7Nox2及Nox4的mRNA水平檢測 應用TRIzol法提取心肌組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，利用PCR儀進行相應指標的特異性擴增，選擇GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法進行定量分析。Nox2及Nox4的特異性引物序列見表1。反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s；60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環。

表1 Nox2及Nox4特異性引物序列

1.2.8心肌膠原含量測定 利用天狼猩紅色染色分析心肌組織膠原含量。具體過程如下：將心肌組織石蠟切片置于二苯甲溶液中5 min，重復3次；相繼經過100%、90%、70%的乙醇1次，各1 min；用流水沖洗標本10 min，沖洗完畢將標本置入純水中清洗1 min，再置于0.2%磷鉬酸中1～5 min，將切片擺放于潮濕的染色盒中，滴入數滴0.1%天狼猩紅苦味酸溶液使其充分與標本接觸，染色90 min；充分甩去天狼猩紅苦味酸溶液，再浸入純水中數次；最后經過70%、95%乙醇各30 s，100%乙醇30 s，各3次。二甲苯2 min，重復3次，封片。染色后用光學顯微鏡拍照，每張切片隨機選取10個視野，使用Image-ProPlus(version6.0)軟件測量膠原面積，從而計算膠原容積百分比(%)，膠原容積百分比(%)=膠原總面積/圖像總面積×100%，取平均值作為最終結果。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察對照組和丹參酮IIA組大鼠精神狀態良好，皮毛色澤光亮，大鼠飲食正常，體質量隨著實驗天數逐漸增加而增加，呼吸平穩正常。單純注射丹參酮IIA組的大鼠表現與對照組相比無明顯變化。纖維化模型組大鼠在造模后精神逐漸變差，行動較為遲緩，食欲不振，皮毛暗淡，體型逐漸消瘦，呼吸頻率加快。纖維化+丹參酮IIA組后期精神尚可，皮毛尚有一點光澤，食欲較好，體型較對照組稍瘦，呼吸較為平穩。

2.2 丹參酮IIA對心衰大鼠心肌NADPH氧化酶活性影響NADPH酶活性：對照組(5.85±0.26)nmol/mg；丹參酮IIA組(5.65±0.33)nmol/mg；纖維化模型組(14.07±0.23)nmol/mg；纖維化+丹參酮IIA組(8.72±0.28)nmol/mg；與對照組比較，丹參酮IIA組的NADPH酶活性無顯著差異，丹參酮IIA的注射對正常大鼠的NADPH氧化酶活性無明顯影響。丹參酮IIA可下調心衰大鼠心肌氧化酶活性(P<0.01)，丹參酮IIA的注射很好地抑制了心衰大鼠心肌NADPH氧化酶活性。

2.3 丹參酮IIA對心衰大鼠心肌組織SOD、MDA的影響由表2可知，大鼠心衰時，心肌組織中SOD

表2 不同處理方式心衰大鼠心肌組織SOD、MDA含量

與對照組比較：##P<0.01；與纖維化模型組比較：**P<0.01

表3 不同處理方式心衰大鼠心肌Nox2、Nox4 mRNA含量

與對照組比較：**P<0.01；與纖維化模型組比較：##P<0.01

活力下降，MDA含量增高，表明氧自由基通過脂質過氧化反應參與了心力衰竭的發病過程。纖維化+丹參酮IIA組的SOD活力優于纖維化模型組(P<0.01)，纖維化模型組MDA含量高于纖維化+丹參酮IIA組，說明心衰大鼠心肌氧化反應活動劇烈。由圖1和表2可知，丹參酮IIA注射后，可以抑制細胞膜上的NADH/NADPH氧化酶的激活，提高SOD的活性。SOD活性的增強，提升了清除氧自由基的能力，MDA含量的降低，顯示脂質過氧化反應作用降低，保護內皮細胞。

圖1 不同處理方式心肌天狼猩紅染色圖片

A：對照組；B：丹參酮IIA組；C：纖維化模型組；D：纖維化+丹參酮IIA組

2.4 心肌Nox2和Nox4基因表達水平與對照組大鼠比較，纖維化模型組和纖維化+丹參酮IIA組大鼠的Nox2 mRNA水平無明顯變化，見表3。而從Nox4 mRNA基因表達可以看出，纖維化模型組和纖維化+丹參酮IIA組大鼠的Nox4 mRNA顯著增加。由于丹參酮IIA的注射，纖維化+丹參酮IIA組大鼠Nox4 mRNA含量較纖維化模型組含量降低，這可能是由于心衰大鼠心肌氧化應激水平增加，Nox4處于激活狀態，而注射丹參酮IIA的心衰大鼠，一定程度抑制了氧化應激水平，所以Nox4 mRNA含量較纖維化模型組含量降低。

2.5 心肌纖維化程度通過天狼猩紅染色觀察心衰大鼠心肌纖維化程度，對照組和丹參酮IIA組在顯微鏡下可見膠原纖維分散在心肌間質；而纖維化模型組和纖維化+丹參酮IIA組心肌間質中不同程度的出現大量膠原纖維，見圖1。通過膠原容積百分比計算得到心衰大鼠心肌膠原含量，纖維化模型組大鼠的心肌膠原容積百分比顯著提高，心肌纖維化程度提高到(32.44±1.27)%，遠高于對照組的(5.13±0.37)%，可見心衰大鼠的心肌纖維化程度遠高于對照組，建模后，丹參酮IIA注射后丹參酮IIA組(5.26±0.48)%，纖維化+丹參酮IIA組的膠原容積百分比為(18.37±1.19)%，說明丹參酮IIA對降低心衰大鼠心肌纖維化水平有顯著作用。

3 討論

丹參酮類化合物是丹參中的特征性有效成分之一，此類化合物具有顯著的心腦血管保護作用和抗腫瘤作用[9-11]。心肌纖維化是以心臟間質成纖維細胞過度增殖、膠原過度沉積及異常分布為特征的心臟間質重構。心肌纖維化與許多心臟疾病有密切關系，如心房纖顫、心肌梗死、慢性心力衰竭、風濕性心瓣膜病等[12]。心肌纖維化時局部心肌細胞凋亡，取而代之的是心肌成纖維細胞增殖和纖維性膠原成分增多，心臟功能逐步減退，最終導致心功能障礙、心力衰竭和心律失常[13]。因此預防及控制心臟間質膠原增生，從而有效防治心肌纖維化，是延緩心力衰竭、減少心律失常發生的重要手段。

ROS通過調節細胞增殖、分化、遷移等過程維持心臟正常功能，而ROS生成增多引起的氧化應激參與了多種心血管疾病，NADPH 氧化酶是ROS 最重要的來源之一。研究[14]顯示，使用 NADPH 氧化酶抑制劑或敲除 NADPH 氧化酶的基因可以明顯減輕氧化損傷。本研究顯示，心衰時NADPH氧化酶活性增強，達到(14.07±0.23)nmol/mg，丹參酮IIA注射后，NADPH氧化酶活性降到(8.72±0.28)nmol/mg，NADPH氧化酶活性受到很好地抑制。MDA水平間接反映心肌氧化應激程度，研究顯示心衰患者心肌MDA水平增加，提示心肌氧化應激水平增加。通過對心肌Nox2和Nox4基因表達測定，心衰大鼠Nox4處于持續激活狀態，Nox2基因無明顯變化。注射丹參酮IIA的心衰大鼠，Nox4 mRNA較模型組含量降低，說明丹參酮IIA可調控調節Nox4的表達。Nox4表達水平的增高可能是心肌NADPH氧化酶活性上調的主要原因。通過天狼猩紅染色，不同處理方式下心肌細胞不同程度地出現大量膠原纖維，通過膠原含量百分比測定，心衰大鼠的膠原含量為(32.44±1.27)%，而注射丹參酮IIA心衰大鼠的膠原含量為(18.37±1.19)%，丹參酮IIA對心衰大鼠心肌纖維化有一定的抑制作用，從而顯著改善心衰大鼠心臟功能。本研究分析顯示，丹參酮 IIA注射可抑制心衰大鼠心肌NADPH氧化酶活性，升高SOD活力，提升清除氧自由基的能力，抑制脂質過氧化反應；MDA含量的降低，降低氧自由基通過脂質過氧化反應造成的心力衰竭的發病過程；丹參酮IIA的注射，Nox4 mRNA含量較模型組低，且顯著降低心衰大鼠心肌纖維化水平，說明Nox4表達一定程度上促進了心肌纖維化水平。