Rac1抑制劑對高糖誘導大鼠腎小球系膜細胞損傷的影響及其作用機制

范高霞, 甘 甜, 周曉燕, 凌宏威, 應長江，李 偉

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的微血管并發癥，Zhang et al[1]研究發現DN患者住院率逐漸增加，給社會帶來極大地經濟負擔。DN的發生與遺傳易感性、高血糖、低度炎癥狀態、血管內皮細胞功能紊亂等多種因素有關，但其具體發病機制尚不明確。已知腎小球系膜細胞是腎小球的主要功能細胞，在人體正常生理狀態下能夠收縮細胞骨架，分泌細胞因子。體外研究[2]表明高糖環境可誘導腎小球系膜細胞增殖、系膜細胞基質增生，同時持續的高糖刺激會引起腎小球系膜細胞凋亡。因此，抑制腎小球系膜細胞的異常增殖與凋亡，對于改善高糖引起的腎小球系膜細胞損傷，延緩DN的發展起到重要作用。Ras相關的C3肉毒桿菌毒素底物1(Rac1)是鳥苷三磷酸水解酶(GTPases)的Rac家族成員，在調節增殖、凋亡、分化中起著重要作用[3-4]。體外研究[5-6]表明，敲除Rac1或抑制c-Jun氨基末端激酶(c-jun n-terminal kinase，JNK)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路可以減輕腎臟損傷，但是Rac1與JNK/NF-κB信號通路之間的關系尚不清楚，為了進一步探究敲除Rac1對腎臟的保護作用是否與JNK/ NF-κB信號通路有關，該研究以腎小球系膜細胞為研究對象，體外模擬高糖環境，檢測NSC23766對其細胞活性、細胞凋亡及p-JNK、NF-κB的蛋白表達的影響，為探索DN的發病機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠腎小球系膜細胞(徐州醫科大學藥理學實驗室贈予)；DMEM培養基、含0.25% EDTA的胰蛋白酶(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；細胞活性檢測試劑盒CCK-8、4%多聚甲醛、Triton X-100、山羊血清、抗熒光猝滅劑(徐州VICMED公司)；AnnexinV-7 AAD/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD Bioscience)；Rac1抑制劑(NSC23766，美國selleck公司)；鼠抗JNK、p-JNK多克隆抗體(美國 Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗NF-κB多克隆抗體(美國Cell Signal Technology公司)；鼠抗活化性半胱天冬酶3(cleaved caspase-3)多克隆抗體、鼠抗Rac1多克隆抗體及組蛋白(H3)多克隆抗體、β-actin抗體及山羊抗鼠、兔IgG抗體、Alexa Flour 488-conjugated Affinipure Goat Ani-Rabbit IgG(美國Proteintech公司)；二甲啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒、配膠試劑盒、DAPI (上海碧云天有限公司)；37 ℃、5% CO2培養箱(美國Thermo公司)；奧德賽雙色紅外激光成像掃描儀(中國香港基因有限公司)；智能激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus F v 10i，日本奧林巴斯光學公司)。

1.2 研究方法

1.2.1大鼠腎小球系膜細胞的培養[7]提前預熱含有10%胎牛血清、含1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM低糖培養基，同時打開水浴箱并設置37 ℃，打開超凈臺紫外線，30 min后將細胞從液氮罐中拿出并迅速放入37 ℃水浴箱中，輕柔快速的晃動至解凍，約1 min時間，75%酒精擦拭外表面后迅速轉入超凈臺，將細胞懸于5 ml DMEM低糖完全培養基中，吹打均勻后離心，棄去培養基，將細胞重懸，取1滴計數，調整細胞密度至5×105個/ml密度接種至10 cm培養皿中，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養。2～3 d后，光鏡下觀察細胞匯合度達80%以上即傳代，按細胞密度為5×105個/ml進行傳代培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2優化實驗條件及實驗分組 取不同的糖濃度刺激大鼠腎小球系膜細胞，同時采用不同濃度的甘露醇以排除由于高糖產生的滲透壓對細胞的影響。前期實驗表明在25 mmol/L的高糖條件下，12 h和24 h系膜細胞活力增加，48 h和72 h系膜細胞活力降低[8]。因此本實驗選擇該實驗條件進行下一步實驗。細胞生長至對數期后，細胞用無血清DMEM低糖培養基培養24 h后(同步化)，將大鼠腎小球系膜細胞隨機分為正常糖組(NG組，含5.6 mmol/L葡萄糖的低糖培養基)、高糖刺激組(HG組，含25 mmol/L葡萄糖的高糖培養基)、高糖刺激+NSC23766組(HG+NSC組，含25 mmol/L葡萄糖+不同濃度的NSC23766)、溶劑對照組(HG+DMSO組，含25 mmol/L葡萄糖+與藥物干預組同體積的DMSO試劑)、滲透壓對照甘露醇組(MG組，含5.6 mmol/L葡萄糖+19.4 mmo/L的甘露醇)，每24 h更換培養基，培養48 h。

1.2.3NSC23766干預檢測高糖誘導腎小球系膜細胞活力的影響 細胞以1×105個/ml接種于96孔板內，100 μl/孔。按照1.2.2方法進行細胞培養，細胞培養48 h后，加入CCK-8溶液，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育2 h后用酶標儀在450 nm波長處測定每孔吸光度(optical density,OD)值，每個實驗組設6個復孔，重復3次。

1.2.4流式細胞儀檢測各組腎小球系膜細胞凋亡率 細胞以5×105個/ml接種于6孔板內，2 ml/孔，按照實驗分組干預48 h后，用不含EDTA的胰酶將細胞消化下來，離心，重懸，取1×106個/100 μl細胞于流式管中，細胞清洗3次后分別加入5 μl Annexin V和5 μl 7 AAD，輕柔渦旋后，室溫避光孵育15 min后使用流式細胞儀檢測各組大鼠腎小球系膜細胞的凋亡率，實驗重復3次。

1.2.5Western blot檢測各組細胞p-JNK、Cleaved caspase-3蛋白表達及NF-κB核轉入情況 各組大鼠腎小球系膜細胞按照1.2.2中實驗方法培養48 h后，根據試劑盒說明書提取胞質及胞核蛋白，提取過程中加入磷酸酶抑制劑。用BCA法檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品煮沸變性后在8%～12% SDS-PAGE 凝膠進行電泳，轉移到硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane, NC)膜上。3% BSA或牛奶室溫封閉2 h，一抗JNK、p-JNK、NF-κB、Cleaved caspase-3、H3、β-actin按照1 ∶500濃度，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜3次，二抗濃度為1 ∶500，室溫閉光孵育2 h，TBST清洗3次后在奧德賽雙色紅外激光成像系統掃描，Image J軟件進行圖像分析處理。

1.2.6智能激光共聚焦顯微鏡分析各組細胞NF-κB表達情況 各組大鼠腎小球系膜細胞接種于NEST皿中，按照1.2.2中實驗方法培養48 h后，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，0.3 %的Triton X-100破膜30 min,10%山羊血清封閉1 h, 加入抗NF-κB抗體按照1 ∶400于4 ℃冰箱孵育過夜，PBS清洗3次，山羊抗兔熒光二抗室溫避光孵育2 h, PBS清洗3次，DAPI染核10 min, PBS清洗后封片，于智能激光共聚焦顯微鏡拍照。

2 結果

2.1 NSC23766藥物濃度的篩選與NG組(1.846±0.045)比較，HG組(0.611±0.092)細胞活力明顯降低(F=863.064，P<0.05)；與HG組比較，HG+NSC(2.5 μmol/L)組(0.626±0.097)及HG+NSC(5 μmol/L) 組(0.645±0.095)細胞活力升高，但是差異無統計學意義(F=0.184，P>0.05)，HG+NSC(10 μmol/L)組(1.313±0.061)細胞活力升高較明顯，與HG組比較差異有統計學意義(F=289.748，P<0.05)；提示NSC23766濃度在10 μmol/L時對腎小球系膜細胞具有保護作用，見圖1。

圖1 CCK-8檢測NSC23766對高糖誘導的腎小球系膜細胞的影響

1：NG組；2：HG組；3：HG+ NSC(2.5 μmol/L)組; 4: HG+NSC(5 μmol/L)組;5: HG+NSC(10 μmol/L)組;6: HG+NSC(20 μmol/L)組;7: HG+DMSO組;8:MG組;與NG組比較:*P<0.05；與HG組比較:#P<0.05；與HG+NSC(10 μmol/L)組比較:△P<0.05

2.2 NSC23766對各組腎小球系膜細胞活力的影響與NG組(1.820±0.025)比較，HG組(0.661±0.054)大鼠系膜細胞活力明顯降低(F=2.251，P<0.05)；與HG組比較，HG+NSC(10 μmol/L)組(1.260±0.016)細胞活力明顯增加(F=685.583，P<0.05)；與HG+NSC(10 μmol/L)組比較，HG+DMSO組(0.645±0.028)細胞活力降低(F=2.114,P<0.05)。見圖2。

2.3 流式細胞儀檢測各組大鼠腎小球系膜細胞凋亡率與NG組(14.950±0.217)比較，HG組(26.300±2.000)大鼠腎小球系膜細胞凋亡率明顯增加(F=1.172，P<0.05)；與HG組比較，HG+NSC(10 μmol/L)組(19.100±1.000)大鼠腎小球系膜細胞凋亡率明顯降低(F=31.104，P<0.05)；與HG+NSC(10 μmol/L)組比較，HG+DMSO組(27.100±1.000)大鼠腎小球系膜細胞凋亡率明顯增加(F=96.000，P<0.05)。見圖3。

2.4 Western blot檢測各組細胞p-JNK、Cleavedcaspase-3蛋白表達及NF-κB核轉入情況與NG組比較，HG組的p-JNK、Cleaved caspase-3 的蛋白表達水平增加，NF-κB核轉入水平增加(P<0.05)；與HG組比較，HG+NSC(10 μmol/L)組大鼠腎小球系膜細胞p-JNK、Cleaved caspase-3 的蛋白表達水平降低，NF-κB核轉入水平降低(P<0.05)；與HG+NSC(10 μmol/L)組比較，HG+DMSO組細胞 p-JNK、Cleaved caspase-3表達水平增加，p-JNK、Cleaved caspase-3的蛋白表達水平增加，NF-κB核轉入水平增加(P<0.05)，各指標每組間差異有統計學意義(Fp-JNK=959.200、FCleaved caspase-3=435.780、FNF-κB=60.090，P<0.05)。見圖4。

圖2 CCK-8檢測各組腎小球系膜細胞活力

1：NG組；2：HG組；3：HG+NSC(10 μmol/L)組; 4: HG+DMSO組;5:MG組;與NG組比較：*P<0.05；與HG組比較：#P<0.05；與HG+NSC(10 μmol/L)組比較：△P<0.05

2.5 共聚焦顯微鏡分析各組細胞中NF-κB表達情況與NG組細胞比較，HG組細胞綠色熒光入核量增加；與HG組細胞比較，HG+NSC(10 μmol/L)組綠色熒光入核量減少，提示高糖刺激可增加NF-κB核轉入，Rac1抑制劑(NSC23766)可減少高糖刺激引起的NF-κB核轉入量。見圖5。

3 討論

系膜細胞又稱間充質細胞，位于腎小球毛細血管袢之間，對于維持腎小球系膜細胞結構具有重要作用。高血糖誘導腎小球基底膜彌漫性增厚與腎小球系膜細胞增殖、肥大、凋亡有關，是腎小球功能喪失和腎小管間質纖維化的主要原因[9]。本研究顯示NSC23766作用后腎小球系膜細胞活性明顯增加，凋亡率顯著降低。本課題組前期研究與Lin et al[10]研究結果一致。說明NSC23766對高糖誘導的腎小球系膜細胞損傷具有保護作用，但是其機制尚不清楚。

圖3 流式細胞儀檢測各組腎小球系膜細胞凋亡率

1：NG組；2：HG組；3：HG+NSC(10 μmol/L)組; 4: HG+DMSO組;5:MG組;與NG組比較：*P<0.05；與HG組比較：#P<0.05；與HG+NSC(10 μmol/L)組比較：△P<0.05

圖4 Western blot法檢測各組腎小球系膜細胞p-JNK、NF-κB、Cleaved caspase-3蛋白表達情況

1：NG組；2：HG組；3：HG+NSC(10 μmol/L)組; 4: HG+DMSO組;5:MG組;與NG組比較：*P<0.05；與HG組比較：#P<0.05；與 HG+NSC(10 μmol/L)組比較：△P<0.05

研究[11]表明，JNK的磷酸化與腎小球系膜細胞損傷密切相關，正常情況下，JNK以去磷酸化形式存在，外界刺激下JNK的氨基末端殘基磷酸化，形成p-JNK，發揮其生物學效應。在糖尿病大鼠模型中，抑制JNK磷酸化，可以減少NF-κB核轉入，并且顯著降低凋亡啟動子Cleaved caspase-3的表達，從而減輕腎臟損傷[6,12]。本研究結果表明，高糖環境下腎小球系膜細胞 p-JNK、Cleaved caspase-3的蛋白表達水平增加，NF-κB的核轉入水平增加。NSC23766作用后p-JNK、Cleaved caspase-3的蛋白表達水平下降，NF-κB的核轉入水平減少，由此可見， NSC23766是通過抑制JNK/NF-κB信號通路對高糖引起的系膜細胞損傷起到保護作用。

Rac1是細胞內重要的信號轉導分子，其有GTPase結合區，因此表現出GTP酶活性, GTP酶在有活性的三磷酸鳥苷(GTP)與無活性的二磷酸鳥苷(GDP)兩種構象之間的循環過程起著多條信號轉導通路的“分子開關”作用,使得Rac1可在活性型GTP 結合形式和限制型或失活型GDP結合形式兩種構象之間進行循環[13]。NSC23766是一種Rac1 GTPase抑制劑，通過鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs),靶向抑制Rac1活性。研究[14-15]表明NSC23766對于腎小球疾病起保護作用，其可能的機制與抗炎、抗凋亡、抗氧化有關，但是其對腎臟保護作用具體信號通路尚不明確。本研究表明：NSC23766作用后抑制了Rac1/JNK/NF-κB信號通路從而對高糖誘導的腎小球系膜細胞起到保護作用，但是有研究[15]表明足細胞特異性Rac1缺失通過Rac1/PAK1/β-catenin信號通路可以改善鏈脲菌素誘導的DN小鼠足細胞損傷和蛋白尿，由此可見抑制Rac1活性還可能與其他信號通路有關，其詳細機制有待進一步研究。

圖5 智能激光共聚焦顯微鏡分析各組腎小球系膜細胞NF-κB蛋白表達情況 ×600

綜上所述，本研究表明 NSC23766對高糖誘導腎小球系膜細胞具有保護作用，其分子機制可能與抑制Rac1/JNK/NF-κB通路有關，本研究為DN的發生機制提供相關依據。