小檗堿靶向結合VEGFR2抑制血管生成作用的研究

李 力，武明飛，余宏鑄

惡性腫瘤是嚴重影響人體健康和威脅人類生命的重要疾病之一，已成為人類死亡的第二個原因，也是最難治療的疾病之一。血管生成是腫瘤生長和轉移的關鍵過程。沒有血管生成，最大的腫瘤只能長到1～2 mm，很容易使用傳統的化療藥物治療[1-2]。因此，通過阻斷腫瘤血管生成，已成為抑制腫瘤生長的腫瘤治療新策略[3]。

小檗堿又稱黃連素，占黃連總生物堿的40%左右，屬于季銨型異喹啉類生物堿，是中藥黃連的主要生物堿，其含量高達5%～8%，不僅含量最高，且是其主要有效成分[4]。現代藥理學證明小檗堿具有廣泛的藥理學作用，其中小檗堿作為抗腫瘤藥物的文獻已經具有很多生藥學和臨床學的證據。研究[5]表明小檗堿能夠通過誘導腫瘤細胞程序性死亡、抑制遺傳信息合成、阻滯細胞周期等機制抑制腫瘤細胞增殖，其在腫瘤防治方面具有潛在的應用前景。課題組采用計算機反向虛擬篩選發現，小檗堿與腫瘤血管生成密切相關的血管內皮細胞生長因子受體2 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)有良好的結合作用，因此推斷該小分子具有抗腫瘤血管生成的潛能。該研究為了驗證這一推論，采用了EA.hy926細胞(人臍靜脈內皮細胞HUVEC與肝癌細胞A549融合株)為模型，進行了一系列體內外實驗，評價小檗堿的抗血管生成作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1試劑及來源 小檗堿、3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物(MTT)購自美國Sigma公司；兔抗人抗體(PI3K、Akt、mTOR和P70S6K)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；抗β-肌動蛋白，磷酸特異性抗體[抗Akt(Ser 473)、抗mTOR(Ser2448)和抗-P70S6K(Thr 389)]、VEGFR2蛋白、VEGFR2酶ELISA試劑盒購自美國Cell Signaling Technology公司；TRIzol試劑、蛋白酶抑制劑混合物購自上海碧云天生物技術有限公司；PBS緩沖液、培養基(DMEM)和胎牛血清購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2實驗細胞 人臍靜脈內皮細胞與肺癌細胞A549融合株EA.hy926細胞株購自中科院上海細胞庫。

1.2 實驗方法

1.2.1反向找靶及分子對接 采用Discovery Studio 2017R2進行反向找靶。配體首先使用DS 2017 R2進行結構優化，隨后對蛋白和配體進行加氫和電荷，最后采用Discovery Studio 2017R2對接程序進行分子對接及分析結果。根據反向對接結果，選擇VEGFR2(PDB號：3vid)為潛在靶點，使用Libdock程序進行再次對接，并分析配體與蛋白之間的作用模式。所有蛋白質晶體結構來源于Protein Data Bank數據庫。

1.2.2表面等離子體共振實驗(surface plasmon resonance,SPR)實驗 采用GE Biacore T200生物大分子相互作用分析儀進行操作。首先將生物素(100 nmol/L)標記的VEGFR2固定在帶有鏈親和素標記的芯片上。其次將6種不同濃度的小檗堿溶液以20 μl/min 的速度流過芯片，整個過程持續5 min；化合物和蛋白結合后，再用緩沖液沖洗10 min，最后用Biacore T200分析軟件2.1分析結果。

1.2.3酶活性測試實驗 按照VEGFR2 ELISA試劑盒的說明書操作。

1.2.4細胞培養 在補充有10%胎牛血清和鏈霉素/青霉素(100 U/ml)的DMEM培養基中培養EA.hy926細胞。

1.2.5MTT實驗 將細胞鋪在96孔板中，培養24 h后，與各種濃度的小檗堿(0、5、10、20、40、80 μmol/L)在37 ℃共孵育48 h。棄去培養基，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)繼續孵育4 h，然后將DMSO(100 μl/孔)加入到每孔中，震蕩，在492 nm波長處測定吸光度。所有的測量結果一式三份。

1.2.6劃痕實驗 EA.hy926在6孔板中長滿單層后，用移液槍槍頭在細胞底層劃一條直線，棄去培養基，用100×放大倍數的顯微鏡拍照記錄，然后加入含有不同濃度小檗堿的培養基繼續培養24 h，棄去培養基，再次拍照記錄，計算遷移率。所有實驗操作3次。

1.2.7雞胚絨毛尿囊膜 (chick embryo chorioallantoic membrane, CAM)膜實驗 取孵育8 d的雞胚，在氣室端開一個1 cm×1 cm的小孔，將配制好的含有不同濃度的小檗堿的小紙片(半徑2.5 mm)貼在血管較少部位，封閉，37 ℃溫箱中無菌培養3 d后將雞胚轉移到4 ℃冰箱中凍存，24 h后剝離CAM，平鋪，拍照，記錄結果。

1.2.8Western blot實驗 不同濃度的小檗堿與EA.hy926細胞共孵育48 h后，收集細胞，提取總蛋白，BAC法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將將漂洗后的凝膠轉移到PVDF膜上。隨后將膜在室溫下用5%脫水脫脂牛奶封閉膜2 h。之后TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min。然后將轉好的PVDF膜與一抗在4 ℃中溫育過夜。隨后在室溫下加入與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的二抗(山羊抗兔IgG-HRP抗體)1 h。未結合抗體用TBST洗滌3次，每次15 min。最后使用增強的化學發光試劑將印跡中的特定蛋白質可視化，最后用凝膠成像系統分析結果。

2 結果

2.1 反向找靶針對Discovery studio 2017R2自帶的藥物靶點晶體結構數據庫反向虛擬篩選，結果顯示小檗堿能夠結合多種靶點(圖1)，其結合能力用契合值表示，契合值越大，結合能力越強。取打分前十的結果分析(表1)，結果顯示小檗堿能夠與VEGFR2的產生良好的結合作用，提示VEGFR2可能是小檗堿的重要靶點之一。

圖1 Discovery Studio 2017R2分析預測小檗堿的蛋白質靶標

表1 Discovery Studio 2017R2預測的排名前十位的蛋白質靶標

分子對接分析了小檗堿與VEGFR2的結合模式。如圖2所示，小檗堿能夠通過多重作用結合到VEGFR2的活性位點，結合方式包括分之間氫鍵、與芳香氨基酸殘基之間的Π-Π堆積作用、p-Π堆積作用等。這一結果提示了小檗堿與VEGFR2結合契合值高的原因。

圖2 小檗堿與VEGFR2(PDB號：3vid)的結合模式圖

A：小檗堿插入VEGFR2活性位點的三維圖；B：VEGFR2活性位點與小檗堿相互作用的氨基酸殘基；C：VEGFR2活性位點的氨基酸殘基與小檗堿相互作用的二維模式圖

2.2 小檗堿與VEGFR2良好的結合作用并顯著抑制VEGFR2激酶的活性為進一步證實小檗堿與VEGFR2的結合作用，本研究開展SPR實驗。過程如圖3所示，圖中的6條線代表不同濃度的小檗堿與VEGFR2的結合情況。分析結果顯示，小檗堿對VEGFR2的結合常數KD值達到0.652 64 μmol/L，說明小檗堿在體外與VEGFR2有良好的結合作用。

圖3 SPR 法測定小檗堿與VEGFR2蛋白的結合作用

酶抑制實驗評價了小檗堿對VEGFR2激酶活性的抑制作用。結果如圖4所示，小檗堿對VEGFR2激酶活性的抑制作用呈劑量依賴性。相對于空白對照組，在8 μmol/L濃度時酶活性抑制率即達到50 %以下，且差異具有統計學意義(t=23.63,P=0.001 7)。經擬合得到酶抑制活性半數抑制濃度(IC50)值為(5.48±0.37)μmol/L，其數量級與陽性對照藥物Semaxanib(IC50)=(1.67±0.16) μmol/L相當。

2.3 小檗堿抑制EA.hy926的增殖與遷移MTT實驗結果顯示，小檗堿對EA.hy926有中等強度的細胞毒性，IC50值為(15.18±1.04) μmol/L。基于這一實驗結果，在非毒性濃度條件下，評價了小檗堿抑制EA.hy926的遷移作用。遷移實驗結果如圖5所示，相對于空白對照組，5 μmol/L濃度的小檗堿干預24 h后，EA.hy926細胞的遷移能力明顯受到抑制，相對遷移率下降到(62.13±2.34)%，差異有統計學意義(t=5.988,P=0.039)，且這種抑制作用隨小檗堿濃度的增加而增強，在10 μmol/L濃度時，相對遷移率下降到(41.64±3.71)%，差異有統計學意義(t=15.38,P=0.016)。

2.4 小檗堿對CAM血管生成的抑制作用與空白對照組(使用0.9% NaCl溶液作為空白對照)比較，小檗堿可顯著抑制新血管增殖，顯示出明顯的抗血管生成活性。如圖6所示，小檗堿10 μmol/L濃度組在載樣濾紙片周圍表現出血管網分布稀少、分叉程度低的結果，而陰性對照組的血管網表現出血管分布均勻、粗大、形成多級分叉的現象；20 μmol/L濃度組則顯示出更為顯著的抗血管生成活性。除此之外，測試物濾紙片周圍血管顏色鮮紅，說明測試物沒有影響原有血管的活性。由此可見，小檗堿在一定濃度范圍內，隨著濃度越大，小檗堿的抗血管生成活性越明顯。

圖4 小檗堿和Semaxanib對VEGFR2激酶的抑制作用

A：小檗堿對VEGFR2激酶酶活抑制曲線；B：Semaxanib對VEGFR2激酶酶活抑制曲線；與空白對照組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.5 小檗堿抑制EA.hy926中VEGFR2介導的Akt/mTOR/P70S6K信號傳導的活化小檗堿與EA.hy926作用24 h后能夠顯著抑制VEGFR2下游信號分子如Akt、mTOR和P70S6K的激活(圖7)，這表明小檗堿通過結合制EA.hy926細胞表面的VEGFR2從而阻斷其介導的Akt/mTOR/P70S6K信號傳導途徑來抑制血管生成。

圖5 小檗堿對EA.hy926細胞遷移能力的影響

A: 0、5、10 μmol/L濃度條件下細胞遷移結果；B:相對遷移率；與0 μmol/L小檗堿組比較：*P<0.05

3 討論

小檗堿作為黃連主要活性成分被證明是其清熱燥濕，瀉火解毒等功效的主要成分；現代藥理學研究證實，小檗堿不僅在抗菌消炎、抗腸道細菌感染等傳統藥效方面發揮作用，而且在心血管系統疾病治療、高脂血癥及癌癥等方面的治療也表現出較好的生物活性，具有潛在的廣泛應用價值[4-6]。國內外許多學者對小檗堿進行了大量、深入的研究，不僅實現工業化的生物合成，而且通過對該類化合物的結構改造和修飾合成了一系列衍生物，并進行了相關的藥理活性測試，證實小檗堿能夠誘導多種腫瘤細胞的凋亡和抑制其細胞增殖，其中包括乳腺癌、肺癌、結腸癌、肝癌等[4-5]。關于小檗堿抗腫瘤細胞的機制研究報道雖多，但是深入研究的并不多。對傳統藥物靶點篩選的方式通常是盲目，這種方法耗時耗力，急需引入一種快捷的尋靶方式。反向虛擬篩選是一種對給定藥物或活性小分子通過計算方法找到其潛在藥物靶標的技術。可以用于化合物靶標確證、藥物新作用研究、藥物毒副作用研究。本研究采用反向虛擬篩選技術觀察了小檗堿對Discovery Studio 2017自帶的藥效團模型數據庫的結合作用。結果顯示，在海量的靶點中，小檗堿與VEGFR2有良好的結合作用，其結合模式通過分子對接實驗進行了解析，結果顯示小檗堿能夠多重作用結合到VEGFR2的活性位點。SPR實驗驗證和酶抑制實驗進一步證實了小檗堿與VEGFR2有良好的結合及酶活抑制作用。

圖6 CAM實驗測定的結果A～D：0、5、10、20 μmol/L小檗堿

圖7 小檗堿抑制EA.hy926細胞中Akt/mTOR/P70S6K信號通路的激活

在腫瘤血管新生過程中，許多信號通路起到重要作用，VEGF信號通路尤為重要。VEGFR2作為VEGF信號通路中的關鍵因子，已成為許多抗腫瘤血管生成藥物開發的重要靶點[7]。鑒于小檗堿與VEGFR2的良好結合作用，推斷小檗堿具備抗腫瘤血管生成的能力。為了驗證這一推論，在體內外評價了小檗堿抑制血管生成的作用。研究結果顯示，小檗堿對人臍靜脈內皮細胞與肺癌細胞A549融合細胞株EA.hy926的增殖有明顯的抑制作用，IC50值為(15.18±1.04) μmol/L，其作用機制可能是細胞毒性作用，或是影響細胞周期從而影響細胞增殖，但具體的作用環節仍不清楚，有待進一步的研究。內皮細胞的遷移是血管新生的重要環節[8]，在本研究中采用劃痕實驗評價了藥物干預下EA.hy926細胞的遷移能力。結果顯示，小檗堿能夠顯著抑制EA.hy926 細胞的遷移，且呈劑量依賴性，表明小檗堿對EA.hy926細胞的運動有明顯的抑制作用。CAM法是篩選血管新生抑制劑的一種簡便、快捷的方法，CAM的血管生成早期，機體免疫系統尚未完全建立，因此CAM對各種異物幾乎不發生排斥反應，便于將含有藥物的載體置于其表面，觀察藥物對血管生成的影響[9-10]。為進一步驗證小檗堿的體內抗血管生成能力，使用不同劑量的藥物干預了CAM上小血管的生成。結果顯示與空白對照比較，給藥組的CAM表面血管的生成明顯受到抑制，且藥物濃度越高抑制作用越明顯，且測試物濾紙片周圍血管顏色鮮紅，含血液，說明小檗堿沒有毒死原有的血管，而是抑制了血管的新生。此外，VEGFR2所介導的Akt/mTOR/P70S6K信號傳導最近被確定為新的血管生成功能介質[11-12]，該信號通路的活化是導致腫瘤血管新生的重要機制[13]。用小檗堿干預EA.hy926細胞后，mTOR和P70S6K及其上游激酶Akt的磷酸化急劇下降，表明小檗堿可通過結合VGEFR2阻斷其多個下游信號傳導成分來抑制腫瘤血管生成。

綜上所述，小檗堿能夠結合VEGFR2，抑制VEGFR2的活性，阻斷VEGFR2介導的Akt/mTOR/P70S6K信號通路，抑制EA.hy926細胞的增殖與遷移，抑制CAM表面血管的生成，具有顯著的抗血管生成的活性作用。這些結果提供了對小檗堿的抗血管生成作用涉及的機制的理解，并突出其抗癌潛力，為以后抗癌機制和抗癌藥物的發展和研制提供了一個全新思路。