巴氏殺菌和超巴氏殺菌對牛乳清蛋白結構及熱穩定性的影響

王喜波，張安琪，王玉瑩，崔 強，周國衛，王 琳

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巴氏殺菌和超巴氏殺菌對牛乳清蛋白結構及熱穩定性的影響

王喜波，張安琪，王玉瑩，崔 強，周國衛，王 琳

（東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030）

為了研究巴氏殺菌與超巴氏殺菌處理對牛乳清蛋白結構的影響，采用熱力學和光譜學等方法測定乳清蛋白結構及穩定性。紅外光譜分析結果顯示巴氏殺菌處理對乳清蛋白二級結構影響不顯著，而經超巴氏殺菌處理后的乳清蛋白中-螺旋結構含量顯著減少，無規則卷曲結構含量顯著增多，結構轉變的更為無序，其穩定性更好；熒光光譜分析結構表明經121 ℃、5 s超巴氏殺菌處理的乳清蛋白樣品發生紅移，說明超巴氏殺菌改變了乳清蛋白二級和三級結構；差示掃描量熱法分析結果顯示121 ℃、5 s熱處理的乳清蛋白樣品熱變性溫度為99.9 ℃，高于巴氏殺菌處理的乳清蛋白樣品，表明超巴氏殺菌處理后的乳清蛋白樣品的穩定性顯著提高，期望為制備高品質乳提供理論基礎。

熱處理；結構分析；熱性能；巴氏殺菌；超巴氏殺菌；乳清蛋白

0 引 言

牛乳中乳清蛋白較酪蛋白對熱處理更敏感、更易發生變性，牛乳在加工過程中通常采用熱處理控制微生物生長。國內外常用的巴氏殺菌方法主要有2種[1]：第一種方法是將原料乳加熱到62～65 ℃，持續30 min，稱低溫長時滅菌法，能夠殺滅原料乳中生長型致病菌，滅菌率高達97.3%～99.9%[2]；第二種方法是將牛乳加熱到72～85 ℃，持續15 s，稱高溫短時滅菌法，能夠將全部的病原微生物殺死，但是也會造成少量營養成分的損失以及風味的改變[3]。還有一種熱處理方法被稱為超巴氏殺菌[4]，即采用120～125 ℃，處理數秒，其溫度超過巴氏殺菌的溫度低于超高溫瞬時滅菌溫度。超巴氏殺菌是一種延長貨架期的技術，它最大可能的避免了加工和再包裝過程的污染[5]，其殺菌效果達到99%以上，可以有效控制乳中的微生物指標[6]，并且經過感官和儀器分析表明超巴氏殺菌牛奶具有明顯的煮熟和硫磺味道[7]；Lee等[8]研究不同熱處理條件對液態奶感官知覺的影響，表明低溫短時巴氏殺菌處理的牛奶比超巴氏殺菌牛奶具有更低的烹飪風味；Bogahawaththa等[9]研究了脫脂乳的高壓處理對乳清蛋白結構的影響，并表明高溫長時巴氏殺菌處理對乳蛋白變性影響較小；Jiang等[10]研究熱處理對聚合乳清蛋白濃縮物和聚合乳清蛋白分離物的理化和乳化性能的影響，并通過測定乳清蛋白的黏度、乳化性及理化性質比較兩種蛋白的乳化能力和穩定性。目前，國內外關于超巴氏殺菌處理對牛乳乳清蛋白的結構和熱穩定性研究鮮有報道，本文以新鮮牛乳為原料，以巴氏殺菌為對照，研究超巴氏殺菌熱處理后乳清蛋白的結構及其熱穩定性變化，為高品質乳制品生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛乳（當天產），哈爾濱本地奶站；考馬斯亮藍，甘油，十二烷基磺酸鈉（SDS, sodium dodecyl sulfate），-巰基乙醇，牛血清白蛋白（BSA, bovine albumin），美國通用公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設備

EPS601凝膠電泳儀，美國伯樂公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；PE Pyris 6差示掃描量熱儀，美國PerkinElmer公司；J-815圓二色譜儀，日本佳司科公司；F-4500熒光分光光度計，日本日立公司；Zetasizer Nano S90納米粒度測定儀，馬爾文儀器公司等。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫脂乳的制備及熱處理

將新鮮牛奶進行離心脫脂，離心條件為：4 ℃、4 000 r/min離心30 min，然后棄去上層脂肪，得到脫脂乳。未經過熱處理的脫脂乳作為對照組，將脫脂乳樣品放于水浴鍋中進行低溫長時巴氏殺菌（65 ℃，30 min）和高溫短時巴氏殺菌（72 ℃，15 s），當脫脂乳中心溫度達到試驗所需溫度時開始計時，此處所有溫度的測定均用溫度計進行；采用高壓鍋加熱模擬超巴氏殺菌（121 ℃，5 s），將脫脂乳樣品置于高壓鍋中，設置高壓鍋為試驗溫度，開始加熱，當高壓鍋顯示達到所需溫度和時間后，進行斷電自然泄壓。將熱處理后的脫脂乳迅速于冷水中冷卻至室溫，然后置于4 ℃避光保存。

1.3.2 乳清蛋白的制備

采用等電點沉淀法[11]提取乳清蛋白，用1 mol/L HCl將脫脂乳的pH值調至4.6，然后在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，保留上清液。所用乳清蛋白樣品最后都要用0.45m的注射器過濾器進行過濾，濾液于-20 ℃冷凍保存。

1.3.3 SDS-PAGE凝膠電泳的測定

樣品SDS-PAGE凝膠電泳圖譜的測定是根據Emmanuelle等[12-13]的方法并加以改動。對照樣品和處理樣品分別用去離子水將體積稀釋5倍，混合震蕩，與緩沖液按體積比4∶1進行混合，煮沸5 min后，冷卻至室溫進行上樣，采用120 V恒壓電泳1.5 h。電泳結束，凝膠用蒸餾水清洗3次，然后浸泡在考馬斯亮藍染色液中，進行染色6 h。染色后的凝膠用脫色液浸泡脫色，脫色期間需要更換3次脫色液，至凝膠背景無色為止。

1.3.4 蛋白濃度測定

參考Toyama等的考馬斯亮藍方法[14]制作標準曲線，分別取0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、1.0 mL牛血清白蛋白（BSA, bovine albumin）標準蛋白溶液于試管中，用去離子水補充到0.1 mL，再加入5 mL考馬斯亮藍染液，震蕩搖勻使其充分反應，2 min后于可見光分光光度計595 nm波長下測量其吸光值，繪制標準曲線。其次用相同方法測定乳清蛋白樣品，將其吸光值與標準曲線進行對比，得出待測蛋白濃度。

1.3.5 紅外光譜分析

取100L乳清蛋白溶液，按照Qi等[15]的方法風干處理，設置紅外光譜儀的分辨率為4 cm-1，在波數范圍為4 000 cm-1～400 cm-1進行掃描，掃描次數為32次，利用Peak-Fit 4.12對紅外光譜進行分峰擬合計算。

1.3.6 熒光光譜分析

參考Gu等[16]的方法，將乳清蛋白樣品用去離子水稀釋10倍，設置激發波長為290 nm，在此波長下進行發射波長的掃描，掃描光譜范圍為300～450 nm，掃描速度為60 nm/min，激發和發射狹縫寬度均為5 nm。

1.3.7 粒徑測定

將乳清蛋白溶液用去離子水稀釋5倍，調整顆粒折射率為1.45，分散劑折射率為1.33，顆粒吸收率為0.887 2，采用Zetasizer Nano S90型納米粒度測定儀進行粒徑分布的測定[17]。

1.3.8 DSC曲線的測定

將乳清蛋白溶液置于鋁盒中，密封后放于樣品箱內，室溫條件下平衡8 h，空鋁盒為空白對照，加熱溫度從20～110 ℃，升溫速率為10 ℃/min，得到DSC曲線[18]。

1.3.9 數據分析

2 結果與討論

2.1 乳清蛋白純度及濃度的測定

乳清蛋白的純度測定結果見圖1。由圖1的乳清蛋白電泳圖中可以看出，酪蛋白條帶顏色非常淺，而-乳球蛋白（-Lg）和-乳白蛋白（-La）條帶清晰可見，這說明，該方法提取的乳清蛋白中酪蛋白含量較低，乳清蛋白純度較高。

圖1 等電點沉淀法提取乳清蛋白SDS-PAGE圖 Fig 1 SDS-PAGE patterns of whey protein under isoelectric precipitation

以考馬斯亮藍G250和梯度標準蛋白所形成的絡合物在595 nm處的吸光值為縱坐標，以標準蛋白溶液蛋白濃度為橫坐標，繪出標準曲線，得回歸方程=0.692 09+ 0.005 57，R=0.997 42，乳清蛋白濃度結果如表1所示，65 ℃，30 min和72 ℃，15 s處理的乳清蛋白樣品蛋白濃度下降不明顯，而121 ℃，5 s處理的樣品蛋白濃度降低約50%（從97%降至52%），是因為經高溫熱處理后部分乳清蛋白形成較大的聚集體[19]無法透過0.45m過濾膜，導致蛋白含量減少。

表1 不同熱處理條件下蛋白濃度 Table1 Protein concentration under different heat treatment conditions

2.2 熱處理對乳清蛋白紅外光譜的影響

圖2為不同熱處理條件下乳清蛋白的紅外光譜結果。由圖可以看出，1 500～1 750 cm-1處的峰值發生了變化，這表明由于熱處理使得乳清蛋白二級結構發生了變化。

注：除了121 ℃處理牛乳后提取的乳清蛋白，其他3組的紅外光譜圖重合為一個譜圖。

參考文獻[20-21]可知，二級結構與各個子峰對應關系為：-折疊結構峰為1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1[20]，無規則卷曲結構峰為1 637～1 645 cm-1，-螺旋結構峰為1 646～1 664 cm-1，-轉角結構峰為1 664～1 681 cm-1[21]。將不同熱處理條件下乳清蛋白的酰胺Ⅰ帶紅外光譜做二階導數，并利用Gauss峰型進行擬合，通過峰型處理確定二級結構各峰位，如圖 3所示。

根據峰位指認確定各子峰與二級結構的對應關系后，計算其積分面積，從而得到各二級結構的相對占比，如表2所示，蛋白質二級結構的變化通過表中4種結構含量變化來表示。3種熱處理方式與對照組相比可以看出，蛋白質二級結構發生了變化，均表現為-螺旋和-折疊含量減少，-轉角和無規則卷曲含量增加。其中，65 ℃，30 min組-螺旋和-折疊含量變化最大，-折疊的含量變化相對較小，降低了3.5 %。Lee等[22]研究表明-折疊含量也減少，可能是由于-折疊結構位于蛋白質凝聚體內部，由于較長時間的熱處理，使乳清蛋白中部分蛋白發生凝聚，在經過0.45m的濾膜過濾后-折疊結構隨著凝聚體過濾出去而含量減少。72 ℃，15 s組二級結構含量變化不大，說明此條件對乳清蛋白二級結構無明顯影響。而121 ℃，5 s組-螺旋含量減少最多，表明此條件下蛋白質發生了去折疊，這可能是由于過高溫導致蛋白質分子間或分子內氫鍵的斷裂[23]，超巴氏殺菌處理后乳清蛋白-轉角和無規則卷曲含量的增加是因為在高溫處理時，-折疊結構易轉變為-轉角結構，同時還會發生-轉角向無規則卷曲轉變[24]，而結構變得更為無序，所以超巴氏殺菌處理后乳清蛋白結構會更加穩定。

a. 對照組CKb. 65 ℃，30 min

c. 72 ℃，15 sd. 121 ℃，5 s

2.3 熱處理對乳清蛋白熒光光譜的影響

本研究條件激發波長設為290 nm，以色氨酸（Trp）為發射基團的熒光光譜，如圖4所示，4個樣品的初始濃度基本相同，3種熱處理對乳清蛋白熒光光譜形狀并無顯著影響，但是經過不同熱處理條件后，其色氨酸熒光強度都有所減小，而熒光強度隨著溫度的升高先減小后增大，具體結果表示于表3。

圖4 不同條件熱處理下乳清蛋白熒光光譜圖

表2 不同熱處理條件下乳清蛋白的二級結構占比

由表3可知，最大熒光強度值可以反映色氨酸殘基的微環境情況，乳清蛋白樣品的最大熒光強度值都大于330 nm，當最大熒光強度>330 nm時，表示色氨酸殘基處于蛋白質分子外部的極性環境在中，當最大熒光強度<330 nm時，表示色氨酸殘基處于蛋白質分子內部的非極性環境中[25]，故本研究中乳清蛋白的色氨酸殘基都是位于蛋白質分子外部的極性環境中。與對照組相比，65 ℃，30 min和72 ℃，15 s熱處理的乳清蛋白樣品的最大熒光強度值無明顯變化，而經過121 ℃，5 s熱處理的乳清蛋白樣品的最大熒光強度發生紅移，這說明溫度過高會使維持蛋白質構象的疏水相互作用被破壞，從而引起蛋白質三級結構變化，蛋白的極性環境會增加，導致Trp的側鏈逐漸暴露于溶劑中。與對照樣品相比，經過巴氏殺菌處理的乳清蛋白樣品其熒光強度都降低，而超巴氏殺菌處理的乳清蛋白樣品降低最為顯著，這可能是由于過高溫破壞了蛋白質結構，使發色團暴露到溶劑中去，造成熒光強度降低[26]。

表3 不同熱處理條件下乳清蛋白熒光光譜的λmax及λ值

2.4 熱處理對乳清蛋白粒徑的影響

經過熱處理的乳清蛋白會發生變性，這可能是因為乳清蛋白分子之間或者乳清蛋白與酪蛋白、乳糖之間發生相互作用而形成凝聚物；也可能是因為高溫處理使乳清蛋白三級結構被破壞，從而導致蛋白質發生降解[27]，這都會導致蛋白的平均粒徑發生變化，粒徑是影響乳液穩定性的一個重要因素[28]。圖5和圖6顯示出不同熱處理條件下乳清蛋白的粒徑分布和平均粒徑。

圖5 不同熱處理條件下乳清蛋白粒徑分布圖

圖6 不同熱處理條件下乳清蛋白平均粒徑

由圖5可知，80 %以上的乳清蛋白的粒徑主要分布在100～1 000 nm之間，平均粒徑為171.3 nm。未經過熱處理的對照組乳清蛋白的粒徑分布只出現一個單峰，而65和72 ℃處理的乳清蛋白，表現出雙峰結構，并且分布范圍變寬，這表明熱處理可能導致了可溶性-Lg凝聚體產生，所以出現了雙峰，隨著熱處理溫度的上升，凝聚物的體積微微增大，同時尺寸分布曲線變得更寬，Durand等[29]用色譜法測定乳清蛋白尺寸的結果的趨勢與本試驗的趨勢類似，這是由于經過熱處理后形成的凝聚物的尺寸比天然蛋白質的尺寸大。由圖6可知，72 ℃處理的乳清蛋白的平均粒徑（173.2 nm）比65 ℃處理后的平均粒徑（166.1 nm）大，這可能是由于加熱時間較長而增加了分子間相互作用的時間，從而形成的不溶性凝聚物經過0.45m濾膜過濾而導致粒徑減小。而121 ℃處理后的乳清蛋白只出現一個峰，是由于加熱產生的可溶性凝聚體通過共價鍵與非共價鍵的相互作用重新形成了更大的不溶性凝聚體，無法通過0.45m濾膜過濾后，導致樣品中可溶性蛋白減少。

2.5 熱處理對乳清蛋白熱穩定性的影響

圖7是不同熱處理條件下乳清蛋白的DSC分析圖譜，4個樣品表現出不同的變性溫度和變性焓，這可能是由于4種蛋白質中存在的聚合體是以不同的比例的-Lg、-La、BSA等蛋白質形成的，這些不同蛋白質的共價鍵數以及非共價鍵數存在很大差異，使得蛋白結構也存在巨大差異[30]所致。從圖中可以看出，與對照樣品相比，經過巴氏殺菌熱處理的樣品乳清蛋白初始變性溫度都有所下降，而超巴氏殺菌處理的樣品變性溫度升高，說明超巴氏殺菌處理的乳清蛋白樣品穩定性提高，這可能是因為熱處理改變了蛋白質的空間結構，使4個樣品的分子結構存在差異。

a. 對照組CKb. 65 ℃，30 min

c. 72 ℃，15 sd. 121 ℃，5 s

由表4可知，65 ℃，30 min和72 ℃，15 s處理的2個樣品，都表現為變性溫度下降，熱焓升高，這是生成的-Lg凝聚體對熱較不穩定，雖然都呈現出相同的趨勢，但變化程度有所不同，這可能是由于溫度不同導致兩者的變性程度和方向均有所差異。121 ℃，5 s處理的樣品的變性溫度高于其他樣品，這說明該處理條件下，乳清蛋白的穩定性最好，這可能是由于高溫處理使乳清蛋白充分變性，蛋白中無序結構含量增多，這與紅外光譜測定的乳清蛋白二級結構的變化相吻合。

表4 DSC圖譜峰的綜合分析

3 結 論

1）牛乳經巴氏殺菌后蛋白濃度無明顯變化，超巴氏殺菌使得蛋白濃度下降約50%，加熱溫度超過70 ℃以后乳清蛋白變性顯著；

2）巴氏殺菌對乳清蛋白的二級與三級結構無顯著影響；超巴氏殺菌處理后的乳清蛋白，其二級結構中以-螺旋為主的有序蛋白結構轉變為以無規則卷曲為主的無序蛋白結構，其結構會變得更加穩定；

3）超巴氏殺菌的高溫能夠破壞乳清蛋白的三級結構以及蛋白分子的疏水相互作用，其最大熒光強度發生紅移，使蛋白質微環境的極性增加；

4）超巴氏殺菌后的乳清蛋白熱穩定性增加，其熱變性溫度最高為99.9 ℃，會延長乳的保質期，但其二級三級結構都發生顯著改變，其營養價值也會發生變化。

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Effect of pasteurization and ultra-pasteurization on structure and thermal stability of fresh milk whey protein

Wang Xibo, Zhang Anqi, Wang Yuying, Cui Qiang, Zhou Guowei, Wang Lin

(,,150030,)

Milk is rich in nutrition, and it is a good medium for microorganisms, therefore, heat treatment are commonly used to sterilize in the process of liquid milk processing. Although the heat treatment can kill microorganisms in milk, it is possible to change the nutritional value and functional properties of milk, so it is essential to study the effects of heat treatment on the structural and properties of milk proteins, especially on whey protein monomers and casein monomers. The heat treatment of milk is generally carried out by pasteurized, and the ultra-pasteurized milk is also very popular recently. At present, there are few reports on the effects of heat treatment on the structural properties of milk whey protein. In this paper, defatted milk obtained by centrifugation through fresh milk as raw material. Then, the skim milk is subjected to low temperature long-term and high-temperature pasteurization and ultra-pasteurization treatment, and the casein are extracted by isoelectric precipitation, and finally whey protein was detected by different detection methods and techniques. So the effects of pasteurization and ultra-pasteurization on the structure and thermal stability of whey protein were discussed. The results of the protein concentration and SDS-PAGE gel electrophoresis showed that the whey protein content extracted by the isoelectric point method after heat treatment was high and the casein content was substantially absent. The results of infrared spectroscopy showed that pasteurization had little effect on the secondary structure of whey protein, while the content of-helix in whey protein was significantly reduced after ultra-pasteurization treatment, and the random curl content increased significantly, it indicated that there was no significant change in the secondary structure of whey protein after pasteurization treatment, and the development of disordered structure changed from ordered structure to disordered structure after superpasteurization treatment, thereby improving the thermal stability of whey protein. Fluorescence analysis showed the whey protein sample heat-treated at 121 ℃ for 5 s was red-shifted, indicating that super-pasteurization greatly changed the secondary and tertiary structure of whey protein, it is shown that too high temperature will destroy the tertiary structure of whey protein and increase the polarity of the protein microenvironment. DSC analysis showed thermal denaturation of whey protein sample treated at 121 ℃ for 5 s, the peak temperature was 99.9 ℃, which was higher than that of the pasteurized whey protein sample, indicating that the stability of the whey protein sample after the ultra-pasteurization treatment was significantly improved. This may be due to the ultra-high temperature treatment to fully denature the whey protein and increase the disordered structure in the protein, which also indicates that the whey protein aggregate formed by ultra-high temperature was heat stable and the degree of denaturation was irreversible. The production and demand of dairy products in China are very large and the consumer groups are extensive. Therefore, it is very important to carry out research on the related technology of dairy processing to ensure the quality and safety of dairy products and promote the healthy and rapid development of China’s dairy industry.

heat treatment; structural analysis; thermodynamic properties; pasteurization; ultra-pasteurization; whey protein

2018-10-22

2019-03-11

乳品科學教育部重點實驗室開放課題（KLDS-18-004）

王喜波，教授，博士，研究方向為食品科學。Email：wangxibo@neau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.06.037

TS252.4

A

1002-6819(2019)-06-0307-06

王喜波，張安琪，王玉瑩，崔 強，周國衛，王 琳. 巴氏殺菌和超巴氏殺菌對牛乳清蛋白結構及熱穩定性的影響[J]. 農業工程學報，2019，35(6)：307－313. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.06.037 http://www.tcsae.org

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