毛蕊花苷對大鼠遞增大強度運動下骨骼肌損傷的保護作用研究

朱洪竹 朱梅菊 蔡榮興 張崇林 彭勇 伍人樂

摘 要：目的：研究毛蕊花苷對遞增大強度運動大鼠骨骼肌損傷的保護作用。方法：SD大鼠隨機分為正常對照組（NC）、單純運動組（SE）、運動+毛蕊花苷低劑量組（EVL）、運動+毛蕊花苷中劑量組（EVM）、運動+毛蕊花苷高劑量組（EVH）。采用遞增大強度跑臺運動疲勞模型。實驗末，取血和骨骼肌檢測各組大鼠血清CK酶活性和骨骼肌氧化應激指標及HSP70蛋白表達量，并用光學顯微鏡觀察骨骼肌微細結構改變。結果：1）與SE組相比，毛蕊花苷各劑量組明顯減少了運動引起的血清CK活性的上升（P<0.05或P<0.01），減輕了運動所致的骨骼肌微細結構的異常，且EVH組的效果要好于EVL組和EVM組。2）與SE組相比，毛蕊花苷各劑量組顯著抑制了運動導致的大鼠骨骼肌的氧化應激水平（P<0.05或P<0.01），其中EVH組抗氧化損傷的效果要好于EVL組和EVM組。3）與SE組相比，毛蕊花苷劑量組進一步誘導了運動引起的HSP70的高表達（P<0.05或P<0.01），其中以EVH組的蛋白表達增加更為顯著（P<0.05）。結論：毛蕊花苷對運動大鼠骨骼肌損傷有良好的改善作用，顯示出毛蕊花苷有明顯抗骨骼肌氧化應激和減輕運動性骨骼肌微細結構損傷的保護作用，其中高劑量補充組的改善效果要優于其他劑量組，這可能與其能更好地誘導運動大鼠骨骼肌內源性保護蛋白（HSP70）表達以發揮HSP70保護效應有關。

關鍵詞：毛蕊花苷;HSP70;氧化應激;骨骼肌損傷;動物實驗

中圖分類號：G804.7 文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2019）01-0053-05

過度運動或大強度運動訓練會引起疲勞，常常會造成骨骼肌損傷，嚴重影響運動員的運動成績和身心健康，而運動性骨骼肌損傷目前臨床上尚缺乏有效的防治措施。毛蕊花苷是馬先蒿屬植物的特征性成分之一[1]，屬于苯丙素苷類化合物，該類化合物具有明顯的體外抗骨骼肌疲勞、改善運動小鼠心肌等組織脂質過氧化損傷的作用[2]。但目前有關毛蕊花苷對運動所引起的骨骼肌損傷的保護作用研究很少見。熱休克蛋白70（heat shock protein，HSP70）是一種在高溫、炎癥、運動損傷等應激條件下誘導高表達的內源性保護蛋白[3-4]，與運動關系密切。近年HSP70已成為較受關注的骨骼肌內源性保護途徑之一。毛蕊花苷能否依賴其對HSP70的調節發揮抗骨骼肌損傷的作用，目前研究尚不清楚。本研究擬通過建立遞增大強度跑臺運動疲勞模型，觀察毛蕊花苷對運動大鼠血清酶活性的改變、骨骼肌微細結構變化、氧化應激指標及HSP70表達的影響，為毛蕊花苷作為一種有效的、純天然的抗骨骼肌損傷的防治方法提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

68只體質量（160±20）g的雄性SPF級SD大鼠，購自中國科學院上海實驗動物中心湖南斯萊克景達實驗動物公司（SCXK（湘）2011-0003），置于室溫（23±0.5）℃，濕度40%～60%的環境下飼養。適應3天后，隨機分為正常對照組（NC）、單純運動組（SE）、運動+毛蕊花苷低劑量組（EVL）、運動+毛蕊花苷中劑量組（EVM）、運動+毛蕊花苷高劑量組（EVH），共5組，除NC組8只外，其余均15只。分籠飼養，自由飲食飲水。

1.2 藥物灌胃處理

毛蕊花苷，純度99%，購于北京索萊寶科技有限公司。藥物劑量換算參照文獻[5]，臨用前用生理鹽水混懸，配成相應濃度的藥液。運動+毛蕊花苷低、中、高劑量組（EVL、EVM、EVH），分別按1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg，每天灌胃毛蕊花苷，灌胃體積2 ml/只。正常對照組和單純運動組用等體積的生理鹽水灌胃。1次/天，連續灌胃3周，每次在訓練前2 h內進行。

1.3 運動干預方案

跑臺運動方式是參照文獻[6-7]方法并結合預實驗經驗后改良的。除正常對照組外，其余各組大鼠在坡度為0°的ZH-PT動物實驗跑臺（安徽淮北正華）上進行遞增負荷強度運動，并采用聲、光、電刺激對消極跑動或者不跑的大鼠進行驅趕。每天觀察并記錄大鼠的一般情況。正常對照組大鼠以同樣的條件常規喂養，自由活動，但不施加跑臺訓練干預。訓練時間3周，7天/周，每天1次（具體見表1）。

1.4 主要試劑

免抗鼠HSP70為多克隆抗體，購于武漢博士德生物工程公司。CK、T-SOD、GSH-Px、MDA及考馬斯亮藍蛋白測試盒均購自南京建成生物有限公司，并嚴格按測試盒的說明書進行操作。

1.5 動物取材與指標檢測

1.5.1 動物取材

末次訓練結束后，大鼠稱重，用10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）對大鼠腹腔麻醉，心臟采血，分離血清，待測CK活性。冰浴上分離腓腸肌組織，生理鹽水漂洗濾紙吸干后，標記分裝，一份置10%甲醛溶液中固定作光鏡標本，另一份置液氮中保存，用作HSP70蛋白表達檢測。

1.5.2 指標檢測與方法

1）骨骼肌HE染色切片制備及觀察 固定后的樣品按常規方法制備石蠟切片，在BX41型光學顯微鏡（日本，OLYMPUS公司）下，觀察骨骼肌肌纖維、小血管、肌外膜及炎癥細胞浸潤等結構的改變。

2）血清CK活性、骨骼肌T-SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量 采用生化法（德國，ECOM-F1624型半自動生化分析儀）。

3）HSP70 Western-blotting檢測 取冷凍腓腸肌組織100 mg加入PIPA裂解緩沖液，勻漿、12 000 rpm離心30 min（4℃）、取上清。取少量上清液進行BCA法總蛋白定量。按常規方法上樣、電泳、轉膜、封閉、加一抗（抗體工作濃度為1：500）、二抗后，再依次洗膜、顯影、定影、掃描。用EC3凝膠電泳成像分析軟件（America）系統記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進行定量分析。GAPDH作為內參，計算各組蛋白的相對表達量。

1.6 數據處理

采用SPSS16.0統計軟件，統計結果以均數±標準差（Mean±SD）表示。多組間差異比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組大鼠一般情況

正常對照組（NC）大鼠表現活躍，兩眼有神，神態安祥;單純運動組（SE）大鼠運動后表現為兩眼無神，活動次數降低，遲鈍、逃避反應能力差，毛發稀少無光澤等神疲癥狀;毛蕊花苷各劑量組上述疲勞癥狀明顯減輕。

2.2 各組大鼠血清CK活性、骨骼肌T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的變化

與NC組相比，SE組和毛蕊花苷各劑量干預組（EVL、EVM、EVH）血清CK活性均有升高（均P<0.01）;與SE組相比，EVL、EVM、EVH各干預組血清CK活性均有降低（P<0.05或P<0.01），其中EVH組降低最為明顯且低于EVL組（P<0.05）（見表2）。

與NC組相比，SE組和毛蕊花苷各劑量干預組（EVL、EVM、EVH）骨骼肌T-SOD、GSH-Px活性均有下降（P<0.05或P<0.01）;與SE組相比，EVL、EVM、EVH干預各組兩指標均有增加，其中EVH組增加尤為明顯（P<0.01），且GSH-Px活性顯著高于EVL組（P<0.01）。而MDA含量則呈現相反的趨勢：EVL、EVM、EVH各干預組均低于SE組（P<0.05或P<0.01），以EVH組降低最為明顯，且低于EVL組（P<0.05）（見表2）。

2.3 光鏡觀察結果

光鏡下，正常對照組骨骼肌細胞肌纖維排列整齊，多核，肌膜下可見肌細胞核呈扁橢圓形且分布均勻;單純運動組（即本實驗的運動模型組）部分肌纖維有腫脹、扭曲、節段性斷裂和溶解甚至消失等損傷現象;運動+毛蕊花苷各劑量組肌纖維排列漸趨整齊，部分肌纖維扭曲、斷裂損傷等現象較運動模型組均有減輕，其中尤以高劑量組改善效果最好。

2.4 各組大鼠骨骼肌HSP70蛋白表達的變化

NC組可見少量的HSP70蛋白表達，模型運動SE組HSP70的蛋白表達量較NC組明顯增加（P<0.01）。運動+毛蕊花苷各劑量組HSP70蛋白表達明顯高于SE組（P<0.05或P<0.01），其中高劑量補充的EVH組增加更為顯著，且分別高于中、低劑量補充的EVM組和EVL組（均P<0.01）。

3 討論

運動引起骨骼肌細胞膜結構和功能發生改變，導致骨骼肌肌肉損傷，血清肌酸肌酶（Creatine Kinase，CK）會增加[8]。血清CK活性是間接反映骨骼肌損傷的一個敏感指標，且與肌損傷程度呈正相關[9-10]。本研究結果顯示，運動后CK酶活性的顯著增加，且高出正常水平的近3倍，提示本研究的遞增強度運動引起了大鼠骨骼肌的損傷。此外，HE染色病理切片同時顯示單純運動SE組骨骼肌出現了肌纖維排列異常，節段性斷裂損傷、溶解甚至消失等病理現象，從形態學方面進一步佐證了骨骼肌損傷這一特征。過度運動或大強度運動會導致機體受損，誘發骨骼肌纖維微細結構損傷，并引起HSP70高表達[11-12]。有研究顯示，運動誘導HSP70表達的增加與運動負荷大小和運動周期有關，大鼠心肌HSP70的表達只有在跑速達到或超過24 m/min時才增加[8]。本研究采用3周遞增大強度跑臺運動疲勞模型[13]，通過檢測運動大鼠HSP70表達，發現模型運動SE組大鼠骨骼肌HSP70被強烈誘導表達，這是由于運動引起的高溫、機械應力、運動損傷、自由基生成、細胞內Ca2+濃度升高等應激因素引起細胞結構與功能改變和蛋白質變性損傷，誘導了HSP70的表達上調[14-16]。HSP70的表達量越大，說明機體損傷越嚴重，應激反應越劇烈，與先前研究相類似[17]。

本研究結果同時顯示，SE組大鼠骨骼肌脂質過氧化產物-丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量明顯上升，高于NC組，而總超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）活性則降低，提示運動大鼠抗氧化能力降低，機體自由基生成增加，氧化應激反應增強。這可能與長時間的大強度運動引起的骨骼肌耗氧量增加，機體處于相對缺血缺氧狀態有關。機體缺血缺氧產生的過多氧自由基通過脂質過氧化反應使肌細胞膜發生過氧化損傷，骨骼肌受損，進而誘導HSP70高表達[18]。HSP70是一種重要的應激蛋白，是細胞內環境穩定的、強有力的、內源性保護途徑[19]。隨著3周遞增強度運動誘導產生HSP70的累積，HSP70可能與運動應激后細胞內產生的損傷蛋白質結合，發揮其分子伴侶功能，維持細胞結構的穩定[20]。這是機體應激后產生的一種內源性骨骼肌保護作用機制[21]，其具體機制尚待闡明。

HSP70是一種重要的分子伴侶，其骨骼肌保護作用已被實驗研究所證實[8，11]。HSP70已成為較受關注的骨骼肌內源性保護途徑之一。毛蕊花苷屬于苯丙素苷類化合物，抗氧化作用是該類化合物的主要活性之一[22];其清除氧自由基和抗氧化損傷的能力可能依賴于分子中羥基的數目;毛蕊花苷有兩個相同的苯酚環，其中每個苯酚環上均有兩個鄰位羥基，分子中羥基的數目越多，抗氧化損傷的能力就越強[23]。研究已表明毛蕊花苷有抗運動小鼠疲勞和抗骨骼肌線粒體氧化應激損傷等作用，毛蕊花苷對骨骼肌的保護作用能否依賴其對HSP70的調節實現，目前尚不明確。本研究進一步發現，補充毛蕊花苷后，各劑量組的HSP70蛋白表達明顯高于未補充藥物的運動模型SE組，其中以高劑量補充的EVH組增加更為明顯，說明毛蕊花苷有進一步上調遞增運動引起的骨骼肌HSP70高表達的作用，且其蛋白表達量與毛蕊花苷呈劑量依賴關系;同時骨骼肌抗氧化酶（T-SOD和GSH-Px）活性也顯著高于SE組，而MDA含量則明顯降低，血清CK活性明顯下降，骨骼肌微細結構損傷有所好轉，大鼠疲勞癥狀有所改善，且高劑量毛蕊花苷補充組的效果要好于其他劑量組。提示，毛蕊花苷有可能通過誘導HSP70高表達來實現對損傷蛋白的修復作用而發揮保護效應。研究表明，誘導型HSP70可減輕氧化應激所致的心肌損傷，HSP70對組織缺血再灌注損傷的保護作用可能是通過抗氧化酶（Mn-SOD）的增加來實現減少自由基對機體的損害[24]。以上表明毛蕊花苷提高運動大鼠抗氧化能力，減少脂質過氧化產物對骨骼肌的損傷，保護骨骼肌功能，其抗運動性骨骼肌損傷的作用有可能是通過內源性保護蛋白（HSP70）所介導。此外，毛蕊花苷還能通過提高運動大鼠骨骼肌細胞肌漿網Ca2+-ATP 酶活性，促進細胞內Ca2+轉運，有較明顯的抗運動疲勞和提高大鼠運動能力作用[13]。毛蕊花苷與骨骼肌損傷的關系還待進一步研究。通過有針對性地補充外源性藥物活性成分或運動營養補劑，誘導內源性保護蛋白（HSP70）的合理表達，調動機體內源性自我保護機制[12]，可以減輕運動所引起的骨骼肌損傷。也提示通過補充毛蕊花苷提高HSP70表達以發揮HSP70的細胞保護效應成為可能。

4 小結

遞增強度運動可引起骨骼肌損傷，補充毛蕊花苷后對機體有良好的保護作用，且高劑量組的效果要好于其他劑量組，其機理可能是毛蕊花苷能較好地上調運動引起的骨骼肌內源性保護蛋白（HSP70）高表達，提高骨骼肌抗氧化能力，減少大強度運動對機體造成的脂質過氧化損傷。

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