根癌農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化體系的研究

張 萍

(咸陽職業技術學院，陜西 咸陽 712000)

馬鈴薯為經濟型作物，含有豐富的營養價值且產量高，屬糧蔬兼用型食物，在農業生產和生活食用中備受青睞。隨著馬鈴薯深加工的不斷創新和快餐行業的發展，馬鈴薯食品的發展方向也由鮮食型轉向加工型和專用型。科研工作者常用基因工程技術定向改造基因以改變其性狀特征，獲得新品質特征的馬鈴薯，研究培育出一些優質的抗病蟲害的馬鈴薯新品種。以馬鈴薯作為基因工程研究作物，主要是利用馬鈴薯可以通過無性繁殖快速將轉基因性狀傳遞給后代的優勢[1]。

實驗以馬鈴薯NHD3、NC、NF的莖段為外植體，用根癌農桿菌研究馬鈴薯的遺傳轉化效率，篩選出適合誘導馬鈴薯新品種NHD3、NC、NF愈傷組織生長的培養基，進而研究農桿菌介導的轉化遺傳體系，并分別比較菌液濃度、預培養時間、共培養時間等因素對馬鈴薯遺傳轉化效率的影響，以便為相關研究提供參考及我們后續轉化實驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

(1)馬鈴薯栽培品種NHD3、NC、NF無菌試管苗。

(2)癌農桿菌LBA4404(植物表達載體：pARTG F1-2)。

1.2 試劑及其配制

抗生素、激素以及MS培養基的配制[2]，具體操作如下：

1.3 MS母液配制

(1)母液Ⅰ(20×)：每升含33 g NH4NO3、38 g KNO3、8.8 g CaCl2·2H2O、7.4 g MgS·7H2O、3.4 g KH2PO4；

(2)母液Ⅱ(200×)：每升含166 mgKI、1 240 mg H3BO3、4 460 mg MnSO4·4H2O、1 720 mg ZnSO4·7H2O、50 mg Na2MoO4·2 d H2O、50 mg CaSO4·5H2O、5 mg CoCl2·6H2O；

(3)母液Ⅲ(100×)：每升含5 560 mg FeSO4·7H2O、7 400 mg Na2·EDTA·2H2O；

(4)母液Ⅳ(200×)：每升含100 mg煙酸、100 mg鹽酸吡哆醇、400 mg甘氨酸、20 mg VB1；

1.4 激素配制

(1)NAA(1 mg·mL-1)：稱取100 mg固體NAA，溶解于適量0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液中，用蒸餾水定容至100 mL，0.22 um濾膜過濾滅菌，4℃保存。

(2)IAA(1 mg·mL-1)：稱取100 mg固體IAA，溶解于適量0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液中，用蒸餾水定容至100 mL，0.22 um濾膜過濾滅菌，4℃保存。

(3)6-BA(0.5 mg·mL-1)：稱取100 mg固體6-BA，溶解于少量稀鹽酸中，用蒸餾水定容至200 mL，0.22 um濾膜過濾滅菌，4℃保存。

1.5 培養基

1.5.1 YEB培養基 每升含5.0 g牛肉浸膏、1. 0 g酵母浸膏、5. 0 g蛋白胨、0.5 g MgSO4·7H2O、0. 8 %瓊脂(pH 值7. 2)。

1.5.2 植物培養基 愈傷組織誘導培養基：以MS培養基為基礎，調整NAA 濃度，配制成A、B、C、D、E、F六種愈傷組織誘導培養基，用于篩選愈傷組織誘培養基，具體組成如下：

A：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.1 mg·L-1NAA

B：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1NAA

C：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.3 mg·L-1NAA

D：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.4 mg·L-1NAA

E：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1NAA

F：MS+1.0 mg·L-16-BA +0.6 mg·L-1NAA

1.6 儀器

雙面超凈工作臺(SW-CJ-ZF，蘇州凈化設備有限公司)；小型高壓滅菌鍋(TH-1020，臺灣TIAOHTSTN公司)；光照培養箱(GZP-250型，上海精宏實驗設備有限公司)；生化培養箱(SHP-250型，上海精宏實驗設備有限公司)；氣浴式震蕩器(ZJS-1320，科大創新股份有限公司中佳分公司)；實驗室專用超純水機(KL-RO-20，成都康寧實驗專用純水設備廠)；電熱恒溫水浴鍋(HH-S4型，北京科偉永興儀器有限公司)等。

2 實驗方法

2.1 篩選培養基

2.1.1 組織培養苗的復壯 無菌條件將分別剪取三種馬鈴薯NHD3、NC、NF組培苗莖段若干，含一個腋芽，約1.0～2.0 cm，接種于MS培養基中，每瓶接種6～8個莖段，每個品種接種5～7瓶，培養條件：25±1℃、1 500～2 000 Lx光照。培養時間15 d左右。

2.1.2 愈傷組織誘導培養基的篩選 無菌條件下剪取長勢良好的組織培養苗莖段若干，無腋芽，約1.0～2.0 cm，分別接種于1.6.2中所制的六種不同培養基中，每瓶接種6～8個莖段，每個品種接種5～7瓶，培養條件：25±1℃、1 500～2 000 Lx光照。培養時間：20 d。統計愈傷發生率。

2.2 研究農桿菌介導的馬鈴薯轉化遺傳體系

2.2.1 復壯 無菌條件剪取NHD3馬鈴薯組培苗莖段若干，含一個腋芽，約1.0～2.0 cm，接種于MS培養基中，接種6～8個莖段，培養條件：25±1℃、1 500～2 000 Lx光照。培養時間：15 d左右。

2.2.2 預培養 無菌條件剪取生長健壯的復壯組培苗莖段若干，無腋芽，約0.8～1.5 cm，接種于預培養基中，接種6～8個莖段，預培養條件：25±1℃、1 500～2 000 Lx光照。培養時間：10 d左右。

2.2.3 根瘤工程農桿菌菌液制備 將工程農桿菌LBA4404(含有pARTGF1-2)放入含Kan(70 mg·L-1)、Rif(80 mg·L-1)、Str(40 mg·L-1)的YEB培養基溶液中，避光振蕩培養，培養條件：28℃，260 rpm。培養時間：24～36h。活化菌液后，按1 ∶50的比例進行放大培養，培養時間分別為4、6、8、10、12、14、16 h，取不同培養時間的菌液各取2 mL，測定OD600值，確定出農桿菌達對數生長期的最適振蕩培養時間。將達對數生長期的菌液轉入無菌離心管中，5 000 rpm離心5 min后收集菌體，加入MS培養基并稀釋至所需濃度。

2.2.4 轉化方法 首先對外植體組培苗進行兩天的預培養，再進行農桿菌侵染，最后對侵染后的外植體置于黑暗環境進行共培養。方法：剪取健壯外植體組培莖段(約0.5 cm，無腋芽)，接種于培養基上，置于人工氣候箱(條件：16 h·d-1、25±1℃、光照強度2 000 Lx)預培養2 d，預培養后對農桿菌懸液進行侵染，并不斷搖晃使菌液與外植體充分接觸，數分鐘后取出，拭去表面菌液，再轉入共培養培養基中，置于黑暗環境28℃進行共培養。

2.2.5 優化農桿菌轉化馬鈴薯遺傳轉化體系[4,5]為研究不同轉化條件對馬鈴薯遺傳轉化效率的影響，分別進行以下實驗：

(1)農桿菌濃度的影響。不同離心條件培養過夜的農桿菌菌液，調整OD600值分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，加入MS液體培養基中，分別轉化培養馬鈴薯無菌苗。

(2)莖段預培養時間的影響。剪取生長健壯的NHD3組培苗莖段(0.8～1.0 cm，無腋芽)，接種于預培養基中，在25+ 1℃、1 500Lx光照下預培養。

(3)共培養時間的影響。預培養的外植體在OD600=0.5的農桿菌菌液中浸染8～10 min后，接種于MS固體培養基上，黑暗條件下共培養時間分別為1 d 、2 d 、3 d、4 d、5 d、6 d。

3 結果與分析

3.1 馬鈴薯莖段愈傷組織誘導培養基篩選

馬鈴薯莖段在A、B、C、D、E、F六種馬鈴薯愈傷組織誘導培養基上培養10 d后，莖段邊緣開始長出愈傷，20 d后，外植體分化出愈傷組織基本完成時，統計各品種馬鈴薯出愈外植體個數(結果見表1)。從中可以看出NC、NF、NHD3依次在B、D、C型培養基上出愈率最高，誘導率分別為94.44、97.50、97.56，在這三種培養基中愈傷組織長勢良好，新芽呈新綠色、結構致密。

3.2 菌液濃度的影響

取10 mL對數生長期的農桿菌菌液，5 000 rpm離心5 min，棄上清液，取菌體制備不同濃度梯度的菌液MS培養基，研究農桿菌的不同濃度影響愈傷組織形成效率。結果表明，菌液濃度在OD600為0.6的濃度時誘愈率最高，形成愈傷組織數最多。濃度在OD600為0.2～1.0時可形成愈傷組織。

表1 馬鈴薯莖段愈傷誘導結果統計

注：+++：生長呈新綠色，結構致密；++：生長呈淺綠色，結構較為致密 +：生長呈淺綠色，結構疏松。

表2 菌液濃度影響愈傷組織形成統計

3.3 預培養時間的影響

農桿菌侵染前對外植體進行短時間的預培養，可緩解侵染時農桿菌傷害外植體，促進細胞分裂，使其更容易整合外源DNA，提高轉化效率[6]。由表3可知，莖段抗性愈傷率達最高，預培養的最佳時間為2 d。

表3 預培養時間影響愈傷組織形成統計

3.4 共培養時間的影響

外植體被農桿菌浸染后受體細胞不能立即整合外源基因，需經過一定時間的來完成轉移整合[7]。共培養時間過短或過長，均會影響到轉化效率。所以，確定共培養時間是形成愈傷轉化的重要因素。由表4可知，共培養2 d，愈傷組織誘導率最高。

表4 共培養時間影響愈傷組織形成統計

4 小結與討論

(1)實驗通過組織培養的方法研究馬鈴薯莖段的再生能力，以便建立高效的馬鈴薯再生體系，為后續實驗奠定基礎。研究表明誘導不同品種馬鈴薯莖段形成愈傷組織需要不同種類的激素及濃度[8～9]，使用較多的激素種類為6-BA 、NAA、IAA等，其中6-BA的濃度范圍為1.0～2.0 mg·L-1，本實驗中確定6-BA 的使用濃度為1.0 mg·L-1。而細胞生長素在NAA中活力高，且耐高溫、高壓不易被光分解破壞，所以本實驗選用NAA。從試驗結果來看，“NC”、“NF”、“NHD3”品種在6-BA濃度一致、培養時間為20 d左右時，分別以NAA 為0. 2 mg·L-1、0.3mg·L-1、0.4 mg·L-1時愈傷組織的誘導效果較好。本試驗結果與李娟等報道[13]的相一致。

(2)研究影響轉化效率因素得出結論：① 轉化馬鈴薯莖段需要適當時間的預培養。預培養可促進外植體細胞分裂[10]，使受體細胞易于整合外源DNA，提高轉化效率[11-13]。②確定共培養時間是遺傳轉化效率重要的影響因素，是實現外源基因向外植體轉化成功的關鍵[14]。③合適的農桿菌濃度會影響到外植體形成轉化植株[15]。本實驗在濃度為OD600= 0.6的農桿菌菌液中浸染10 min，抗性愈傷誘導率最高，達87.25%。