不同比例LA/ALA對HepG2細(xì)胞炎癥因子的影響

劉睿杰，塔 薇，王莉梅，常 明，金青哲，王興國

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122；2.無錫易麥園食品有限公司，江蘇 無錫 214000)

多不飽和脂肪酸(PUFAs)是人體必需的重要營養(yǎng)物質(zhì)，包括n-6和n-3 PUFAs，具有抗氧化、抗炎等生理作用，在人體健康中起重要作用。膳食中n-6與n-3 PUFAs 的攝入比例一直備受關(guān)注，但目前各國膳食脂肪酸構(gòu)成比的推薦值不盡相同，諸多體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果中n-6與n-3 PUFAs最佳比例尚無定論。

PUFAs可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程的炎癥因子表達(dá)[1]，是類花生酸前物質(zhì)，可代謝生成抗炎性類花生酸物質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)是炎癥反應(yīng)過程中最重要、最具代表性的細(xì)胞因子，前者對后者有很強(qiáng)的促進(jìn)作用。IL-6是一種自分泌或旁分泌的多效性細(xì)胞因子，在許多細(xì)胞中都有明顯的表達(dá)，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，IL-6的量迅速增加，影響炎癥反應(yīng)過程[2-4]。有報(bào)道稱可通過檢測TNF-α和IL-6水平高低來反映炎癥的嚴(yán)重程度[5]。白介素-10(IL-10)是一種多肽，由多種不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)過度的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的最終結(jié)局方面發(fā)揮多效性作用，可以抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生[6]。PUFAs代謝產(chǎn)生的抗炎性物質(zhì)如脂氧素(LXs)、保護(hù)素等可調(diào)控炎癥反應(yīng)，由PUFAs衍生而來的抗炎性脂氧素是最有效的炎癥調(diào)節(jié)劑[7-8]。

n-3 PUFAs有抗炎作用，可有效抑制TNF-α、IL-6以及IL-1等細(xì)胞炎性因子的產(chǎn)生[9-11]。Weldon等[12]研究發(fā)現(xiàn)，EPA和DHA可抑制人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，n-3 PUFAs通過減少炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、環(huán)氧合酶-2(COX-2)以及IL-1的分泌來抑制大鼠術(shù)后的炎癥反應(yīng)。EPA可有效降低經(jīng)前列腺素刺激的人肝細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6[14]。AA可代謝生成前列腺素E2和白三烯，這兩種物質(zhì)在炎癥反應(yīng)中起很大作用[15]。目前關(guān)注n-3與n-6 PUFAs 比例的研究多集中于EPA和DHA，對植物油中典型的n-3與n-6 PUFAs比例的關(guān)注較少。

本研究通過體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，選取植物油中典型n-3和n-6多不飽和脂肪酸(α-亞麻酸(ALA)和亞油酸(LA))為代表，以促炎因子TNF-α、IL-6以及抗炎因子IL-10和抗炎介質(zhì)LXA4為目標(biāo)因子，研究不同比例LA/ALA對HepG2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

α-亞麻酸(ALA，純度≥99%)、亞油酸(LA，純度≥99%)及四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，美國Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；胰酶及雙抗，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，上海生工生物有限公司；乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀等(分析純)，國藥化學(xué)試劑有限公司；脂多糖(LPS)，美國Sigma公司；TNF-α、IL-6及IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒，南京建成生物工程研究所；LXA4酶聯(lián)免疫試劑盒，上海豐壽實(shí)業(yè)有限公司；人HepG2(ATCC HB-8065)細(xì)胞株，無錫萊弗思生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TS100-F倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、HFU 586 Basic超低溫冰箱，美國Thermo公司；M5酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；SCIENTZ JY 92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；Alpha-l 500紫外可見分光光度計(jì)；血球計(jì)數(shù)器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清以及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2和95%相對濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中，隔天換液，5 d傳代。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為10～30代HepG2細(xì)胞。

1.2.2 不同比例LA/ALA對HepG2細(xì)胞影響

取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，以105個(gè)/mL密度接種于6孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中先加入0.1 μg/mL LPS刺激24 h后，用磷酸緩沖液(PBS)洗兩次，再分別加入終濃度為60 μmol/L各實(shí)驗(yàn)組溶液(見表1)，設(shè)立與實(shí)驗(yàn)組含相同濃度BSA的空白對照組。各組樣品處理24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心除去死細(xì)胞，取上清液待分析。

表1 各實(shí)驗(yàn)組脂肪酸組成

1.2.3 酶聯(lián)免疫法測定細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-10和細(xì)胞脂氧素水平

取1.2.2待分析液，用酶聯(lián)免疫試劑盒測定細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和LXA4水平。以各處理?xiàng)l件下炎性因子表達(dá)量、脂氧素水平相對于空白對照組的含量表示PUFAs處理后的變化。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 不同比例LA/ALA對HepG2細(xì)胞TNF-α和IL-6的影響

LPS誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h后，刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子。60 μmol/L不同比例LA/ALA作用HepG2細(xì)胞24 h后，各實(shí)驗(yàn)組對HepG2細(xì)胞TNF-α和IL-6水平的影響結(jié)果見圖1。

TNF-α和IL-6均是細(xì)胞內(nèi)促炎因子，其水平高低可反映細(xì)胞炎癥的嚴(yán)重程度。由圖1可知，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TNF-α和IL-6的表達(dá)量與空白對照組相比顯著下降(P<0.05)；與組4相比，其余各組TNF-α和IL-6表達(dá)量均顯著上升(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組對HepG2細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)量抑制程度的順序?yàn)榻M4>組3>組2≈組1，組4>組5>組6≈組7。說明不同比例LA/ALA均能降低HepG2細(xì)胞的TNF-α和IL-6表達(dá)量，其中組4作用效果最明顯。

注：*P<0.05，與空白對照組對比的顯著性；#P<0.05，與組4對比的顯著性。下同。

圖1 不同比例LA/ALA對HepG2細(xì)胞TNF-α和IL-6含量的影響

2.2 不同比例LA/ALA對HepG2細(xì)胞IL-10的影響

LPS誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h后，刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子。60 μmol/L不同比例LA/ALA作用HepG2細(xì)胞24 h后，各實(shí)驗(yàn)組對HepG2細(xì)胞分泌IL-10水平的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同比例LA/ALA對HepG2細(xì)胞IL-10含量的影響

IL-10是細(xì)胞內(nèi)的抗炎因子，可以抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，起到免疫調(diào)節(jié)作用，在維持機(jī)體免疫平衡方面發(fā)揮重要作用。由圖2可知，與空白對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10的含量顯著上升(P<0.05)；與組4相比，其余各組IL-10含量均顯著下降(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組對HepG2細(xì)胞IL-10表達(dá)量增加程度的順序?yàn)榻M4>組3>組2≈組1，組4>組5>組6≈組7。說明不同比例LA/ALA均能升高HepG2細(xì)胞的IL-10表達(dá)量，其中組4作用效果最顯著。

2.3 不同比例LA/ALA對HepG2細(xì)胞脂氧素水平的影響

LPS誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h后，刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子。60 μmol/L不同比例LA/ALA作用HepG2細(xì)胞24 h后，各實(shí)驗(yàn)組對HepG2細(xì)胞分泌LXA4水平的影響結(jié)果見圖3。

圖3 不同比例LA/ALA對HepG2細(xì)胞LXA4含量的影響

PUFAs能經(jīng)酶促氧化產(chǎn)生具有抗炎活性的LXA4。由圖3可知，與空白對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組均顯著性促進(jìn)HepG2細(xì)胞LXA4合成(P<0.05)。其余各實(shí)驗(yàn)組與組4相比，LXA4水平明顯均有降低(P<0.05)，作用效果存在差異。作用順序?yàn)榻M4>組3>組2≈組1，組4>組5>組6≈組7，組4對細(xì)胞LXA4水平的增加作用最顯著。

3 結(jié) 論

60 μmol/L不同比例LA/ALA作用經(jīng)LPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞24 h后，各實(shí)驗(yàn)組均顯著抑制HepG2細(xì)胞的促炎因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，增加抗炎因子IL-10的產(chǎn)生。說明不同比例LA/ALA增加了IL-10的表達(dá)量，使抗炎因子IL-10發(fā)揮其多效性，使得促炎因子TNF-α和IL-6表達(dá)量下降，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥，降低炎癥反應(yīng)程度。同時(shí)，不同比例LA/ALA還通過增加抗炎脂類介質(zhì)LXA4含量，影響HepG2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，其中LA與ALA最佳配比為1∶1。