迷迭香葉中鼠尾草酸的超聲破碎提取工藝 及其抗油脂氧化研究

羅小芳， 陳啟燕， 王 釵， 姜紅宇， 王宗成

(1.湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南 永州 425199； 2.湖南省湘南優勢植物資源綜合利用重點實驗室，湖南 永州 425199)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)，屬唇形科迷迭香屬植物，原產于歐洲、北非以及地中海沿岸[1]，1981年中國科學院植物所在我國貴州等地成功進行了引種[2]，目前在廣西、貴州、云南、浙江等地廣泛種植[1]。迷迭香含有豐富的抗氧化成分，主要有二萜類、黃酮類、三萜類等化合物[3]，其中二萜類的鼠尾草酸是含量最高、活性最強的脂溶性抗氧化成分[4]，對油脂具有較好的抗氧化活性[5-7]。此外，鼠尾草酸還具有抗癌、抗炎、抑菌、神經保護等藥理活性[8-10]，已被廣泛用于藥品、食品、化妝品等領域。目前，鼠尾草酸的提取主要以熱回流法[11]為主，耗時長，得率較低，且鼠尾草酸在較高溫度的溶劑中存在時間較長容易轉化為鼠尾草酚[12]，增加后續純化難度，雖然有在較低溫度下的超聲輔助提取鼠尾草酸的報道[12-13]，但是提取時間仍較長。因此，尋求一種高效、快速的鼠尾草酸提取方法具有重要意義。超聲破碎提取法通過將發射超聲波的探頭直接插到混有原料的溶劑中，使原料直接受超聲波的作用，促使原料中的有效成分快速溶于溶劑中，具有操作簡便、工藝周期短、有效成分不被破壞等優點[14]。本文以迷迭香葉為原料，研究了鼠尾草酸的超聲破碎提取工藝，并采用Schaal烘箱法研究迷迭香葉中鼠尾草酸對油脂的抗氧化作用，為迷迭香葉的開發與利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

迷迭香葉(市售)。無水乙醇、磷酸、BHT、BHA、抗壞血酸(VC)、一水檸檬酸，分析純；甲醇，色譜純。

1.1.2 儀器與設備

JYD-1200L超聲波細胞粉碎機，上海之信儀器有限公司；TE124S型電子天平，德國賽多利斯；AHS-370型恒溫烘箱，吳江華東標準烘箱有限公司；RE-201D型旋轉蒸發儀，長沙泰康儀器有限公司；LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 鼠尾草酸的提取

將迷迭香葉放至60℃烘箱干燥2 h，粉碎，過60目篩。精確稱取10.0 g迷迭香葉粉置于250 mL燒杯中，加入一定量的提取溶劑，在一定功率下超聲破碎提取一定時間，提取液抽濾后，準確測量體積，取約10 mL濾液用0.45 μm的聚偏氟乙烯有機微孔濾膜過濾后作為高效液相色譜待測樣品溶液。

1.2.2 高效液相色譜分析條件

月旭C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；檢測波長210 nm；流動相A為0.05%的磷酸水溶液，B為甲醇；流速1.0 mL/min；洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫

1.2.3 標準曲線的繪制

準確稱取鼠尾草酸標準品11.5 mg，用無水乙醇溶解，并定容至10 mL。分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL至10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，取20 μL標準溶液注入液相色譜儀，采用1.2.2色譜分析條件進行測定。以質量(x)為橫坐標，峰面積積分值(y)為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸，得到線性回歸方程y=303 202x+3 423.6(R2=0.999 9)。

1.2.4 樣品溶液的測定

采用1.2.2色譜分析條件，取20 μL待測樣品溶液注入液相色譜儀進行測定，根據線性回歸方程計算樣品溶液中鼠尾草酸的質量濃度，再根據提取液的體積，計算出提取到的鼠尾草酸的質量。參照文獻[11]，采用超聲輔助浸提法反復提取3次迷迭香葉中的鼠尾草酸，測得10 g迷迭香葉中鼠尾草酸的質量為0.308 g。

1.2.5 鼠尾草酸提取率的計算

1.2.6 鼠尾草酸的純化

參考文獻[15]，將迷迭香葉中鼠尾草酸提取后，采取硅膠層析法進行純化。

1.2.7 迷迭香葉中鼠尾草酸抗油脂氧化活性的分析

采用Schaal烘箱法，取50 g食用油置于廣口瓶中，分別加入一定量純化的鼠尾草酸和/或其他抗氧劑，使充分混勻，以無添加的油脂為空白對照，放入(65±1)℃的恒溫烘箱中進行誘導強制氧化，每隔3 d檢測樣品的過氧化值。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對鼠尾草酸提取效果的影響

固定乙醇體積分數80%、超聲時間3 min與超聲功率360 W，考察不同料液比對鼠尾草酸提取率的影響，結果見圖1。

圖1 料液比對迷迭香葉中鼠尾草酸提取率的影響

由圖1可知，當料液比從1∶5增加至1∶15時，鼠尾草酸提取率逐漸提高，繼續增加料液比，鼠尾草酸提取率略有降低。增加料液比可以提高有效成分的擴散速度，有助于鼠尾草酸溶出，但當擴散達到平衡時，增加提取劑不會促進鼠尾草酸的提取，反而使之后的濃縮更為困難。因此，綜合考慮提取所需的能耗，正交試驗選擇料液比為1∶10～1∶20。

2.1.2 乙醇體積分數對鼠尾草酸提取效果的影響

固定超聲時間3 min、料液比1∶10與超聲功率360 W，考察不同乙醇體積分數對鼠尾草酸提取率的影響，結果見圖2。

圖2 乙醇體積分數對迷迭香葉中鼠尾草酸提取率的影響

由圖2可知，乙醇體積分數從60%增加100%時，鼠尾草酸的提取率逐漸升高，當以無水乙醇為溶劑時，鼠尾草酸的提取效果最好。因為鼠尾草酸溶于乙醇，隨著乙醇體積分數的提高，溶解度增大，提取率也隨之提高。因此，正交試驗選取無水乙醇。

2.1.3 超聲功率對鼠尾草酸提取效果的影響

以無水乙醇為溶劑，固定料液比1∶10與超聲時間3 min，考察不同超聲功率對鼠尾草酸提取率的影響，結果見圖3。

由圖3可知，當超聲功率從120 W增加至480 W時，鼠尾草酸提取率提高，繼續增加超聲功率，鼠尾草酸的提取率反而下降。增大超聲功率可以提高植物細胞的破碎度，有助于鼠尾草酸從基質中溶出，但超聲功率過高會破壞鼠尾草酸的結構，降低提取率。因此，正交試驗選擇超聲功率為360～600 W。

圖3 超聲功率對迷迭香葉中鼠尾草酸提取率的影響

2.1.4 超聲時間對鼠尾草酸提取效果的影響

以無水乙醇為溶劑，固定料液比1∶10與超聲功率360 W，考察不同超聲時間對鼠尾草酸提取率的影響，結果見圖4。

圖4 超聲時間對迷迭香葉中鼠尾草酸提取率的影響

由圖4可知，當超聲時間達到2 min時，鼠尾草酸提取率最高，繼續延長超聲時間，鼠尾草酸提取率逐漸下降。因此，正交試驗的超聲時間為1～3 min。

2.2 正交試驗優化

在單因素試驗的基礎上，以鼠尾草酸提取率為指標，選取料液比(A)、超聲功率(B)和超聲時間(C)作為考察因素，采用正交試驗優化迷迭香葉中鼠尾草酸的提取工藝條件，正交試驗因素水平見表2，正交試驗設計與結果見表3，方差分析見表4。

由表3可知，各因素對鼠尾草酸提取率影響大小依次為C>B>A，即超聲時間>超聲功率>料液比，優化工藝組合為A1B3C2。由表4可知，超聲時間對鼠尾草酸提取率的影響顯著，超聲功率和料液比對鼠尾草酸提取率的影響不顯著。最佳工藝條件為料液比1∶10、超聲功率600 W、超聲時間2 min，在此條件下進行6次平行試驗，得到鼠尾草酸的平均提取率為93.6%。與文獻[12-13]相比，提取時間大幅縮短。

表2 正交實驗的因素與水平

表3 正交試驗設計與結果

表4 方差分析

注：F0.05=19.000。

2.3 迷迭香葉中鼠尾草酸對油脂的抗氧化作用

2.3.1 迷迭香葉中鼠尾草酸對不同油脂的抗氧化作用

將0.02%的鼠尾草酸分別添加到豬油、菜籽油和花生油中，同時分別以豬油、菜籽油、花生油作空白對照，按Schaal烘箱法測定3～15 d時油脂的過氧化值，研究鼠尾草酸對不同油脂的抗氧化作用。結果見圖5。

圖5 鼠尾草酸對不同油脂的抗氧化作用

由圖5可知，隨著時間的延長，油樣的過氧化值均有不同程度的上升，但是添加鼠尾草酸的油樣較相應的空白油樣過氧化值增長緩慢，而空白油樣過氧化值急劇上升，表明鼠尾草酸對3種油脂的氧化酸敗都有不同程度的抑制作用。

2.3.2 不同添加量的鼠尾草酸對豬油的抗氧化作用

分別在豬油中添加0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%的鼠尾草酸，同時以豬油作空白對照，測定3～15 d時油脂的過氧化值，研究不同添加量鼠尾草酸對油脂的抗氧化作用。結果見圖6。

圖6 不同添加量的鼠尾草酸對豬油的抗氧化作用

由圖6可知，隨著鼠尾草酸添加量的增大，豬油的過氧化值呈下降趨勢，即其抗氧化效率增強。因此，鼠尾草酸對豬油的抗氧化能力有劑量效應的關系，可以根據實際需要控制鼠尾草酸的添加量達到所需的抗氧化效果。

2.3.3 迷迭香葉中鼠尾草酸與其他抗氧劑對豬油的抗氧化作用

將0.02%鼠尾草酸、0.02%BHT、0.02%BHA、0.02%抗壞血酸、0.02%檸檬酸分別添加至50 g豬油中，同時以豬油作空白對照，測定3～15 d時油脂的過氧化值。結果見圖7。

圖7 鼠尾草酸與其他抗氧劑對豬油的抗氧化作用

由圖7可知，隨著時間的延長，油樣的過氧化值均有不同程度的上升，但加入抗氧劑后的油樣過氧化值都明顯低于空白對照，且鼠尾草酸樣品試驗組總體過氧化值較低，抗氧化效果接近BHT試驗組，鼠尾草酸具有比BHA以及檸檬酸更強的抗氧化性。由此看出，鼠尾草酸有較大的開發潛力。

2.3.4 鼠尾草酸與其他抗氧劑的協同增效作用

分別取0.02%鼠尾草酸與0.02%BHA、0.02%BHT、0.02%抗壞血酸、0.02%檸檬酸4種復配物及0.04%鼠尾草酸分別加入到50 g豬油中，并以豬油作空白對照，測定3～15 d時油脂的過氧化值，研究鼠尾草酸與其他抗氧劑的協同增效作用。結果見圖8。

圖8 鼠尾草酸與其他抗氧劑的協同增效作用

由圖8可知，隨著時間的延長，空白油樣過氧化值急劇上升，而添加鼠尾草酸復配物的油樣明顯低于空白，鼠尾草酸與檸檬酸復配試驗組、鼠尾草酸與抗壞血酸復配試驗組抗氧化效果強于單一鼠尾草酸試驗組，對豬油的抗氧化效果由強到弱依次為抗壞血酸+鼠尾草酸>檸檬酸+鼠尾草酸>鼠尾草酸>BHA+鼠尾草酸>BHT+鼠尾草酸。由此可知，有機酸與抗氧化劑協同使用可增強其抗氧化功能。可能由于有機酸與油中某些金屬離子螯合形成金屬鹽，降低了微量金屬離子對油脂氧化的催化能力，從而增加了鼠尾草酸的抗氧化效果[16-17]。

3 結 論

采用單因素試驗和正交試驗優化了超聲破碎提取迷迭香葉中鼠尾草酸的提取工藝，得到最佳工藝條件為：以無水乙醇為溶劑，料液比1∶10，超聲功率600 W，超聲時間2 min。在最佳工藝條件下，迷迭香葉中鼠尾草酸的提取率可達到93.6%?？寡趸钚苑治霰砻?，迷迭香葉中鼠尾草酸對花生油、菜籽油和豬油都具有較強的抗氧化活性，且對油脂的抗氧化能力與鼠尾草酸添加量呈正相關，鼠尾草酸比BHA以及檸檬酸具有更強的抗油脂氧化活性，且與抗壞血酸和檸檬酸有一定的協同增效作用。