椰子分級蛋白制備的研究

馬開創，黃宏飛，彭吟雪，何東平,2，胡傳榮,2

(1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢 430023；2.國家糧食局糧油資源綜合開發工程技術研究中心，武漢 430023)

椰子不僅可以用來提取油脂，還是油料蛋白的重要來源之一。椰子蛋白中含有人體所需的18種氨基酸，8種必需氨基酸種類齊全，營養價值高，具有降血脂、降低膽固醇、抑制高血脂癥等保健功能[1-3]。

在椰子加工中，椰子蛋白作為加工椰子油等的副產品，基本都用作飼料，造成了椰子蛋白資源的嚴重浪費[4]。雖然在特定區域制備椰子類食品有許多方法，但多數僅限于村莊或家庭規模[5]。如果椰子蛋白可以商業化生產，那么可以同時獲得椰子蛋白和椰子油兩個產品，從而整個椰子生產和加工業將受益匪淺。

目前關于椰子化學成分信息，尤其是蛋白質的信息不全，我國對椰子蛋白的研究報道很少。椰子蛋白中含有30%的清蛋白、61.9%的球蛋白、1.1%的醇溶蛋白和4.7%的谷蛋白[6]。本文對改良Osboren法提取椰子蛋白工藝進行優化，并對椰子蛋白的氨基酸組成和相對分子質量分布進行分析，以期為椰子蛋白的生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

脫脂椰子粉(實驗室自制)；氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、無水乙醇、正己烷、硼酸溶液；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；K9840自動凱氏定氮儀；FD-8型冷凍干燥機；TD5A-WS離心機；PHS-3C型pH計；SZ-93自動雙重純水蒸餾器；垂直電泳儀；BIO-RAD凝膠成像分析系統；S-3000N掃描式電子顯微鏡、E-1055磁控濺射器，日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 椰子蛋白分級提取工藝

(1)清蛋白：取200 g脫脂椰子粉，過100目篩，置于燒杯中，加入一定量的蒸餾水，在恒溫加熱磁力攪拌器中一定溫度下攪拌一段時間，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。沉淀加入蒸餾，再次攪拌浸提，離心。合并兩次所得的上清液，用0.1 mol/L的HCl溶液調節上清液pH至4.5，在恒溫加熱磁力攪拌器中以45℃攪拌2 h，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。所得沉淀水洗至中性，冷凍干燥即為清蛋白。在-4℃條件下儲存。單因素實驗時，固定提取條件為提取溫度50℃、提取時間4 h、液料比10∶1。

(2)球蛋白：將提完清蛋白后的殘渣用一定量0.5 mol/L的NaCl溶液進行浸提，在恒溫加熱磁力攪拌器中一定溫度下攪拌一段時間，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。沉淀加入0.5 mol/L NaCl溶液，再次攪拌浸提，離心。合并兩次所得的上清液后用半透膜在去離子水中過膜72 h，5 000 r/min、4℃離心30 min得到沉淀，冷凍干燥后得到球蛋白。在-4℃條件下儲存。單因素實驗時，固定提取條件為提取溫度50℃、提取時間4 h、液料比10∶1。

(3)醇溶蛋白：將提完球蛋白后的殘渣用一定量乙醇溶液進行浸提，在恒溫加熱磁力攪拌器中一定溫度下攪拌一段時間(用保鮮膜密封)，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。沉淀加入乙醇溶液，再次攪拌浸提，離心。合并兩次所得的上清液后進行旋轉蒸發，冷凍干燥后得到醇溶蛋白。在-4℃條件下儲存。單因素實驗時，固定提取條件為提取溫度50℃、提取時間4 h、乙醇體積分數75%、液料比10∶1。

(4)谷蛋白:將提完醇溶蛋白后的殘渣加入一定量去離子水，滴加0.1 mol/L的NaOH溶液調節pH，在恒溫加熱磁力攪拌器中一定溫度下攪拌一段時間，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。沉淀用NaOH溶液再次攪拌浸提，離心。合并兩次所得的上清液，滴加0.1 mol/L的HCl溶液至溶液pH降至4.5，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。所得沉淀水洗至中性，冷凍干燥即為谷蛋白。在-4℃條件下儲存。單因素實驗時，固定提取條件為提取溫度50℃、提取時間4 h、堿溶pH 10、液料比10∶1。

1.2.2 蛋白質含量的測定

參照GB 5009.5—2016 測定蛋白質含量。

1.2.3 椰子蛋白凝膠電泳分析

稱取椰子蛋白樣品0.01 g溶于5 mL上樣緩沖液中，放入10 mL EP管中，渦旋振蕩1 min后，在10 000 r/min下離心10 min，移液槍準確移取40 μL上清液與10 μL蛋白緩沖液充分混勻，在100℃加熱3 min使蛋白質變性，準備上樣。樣品蛋白采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，按照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒方法進行檢測。使用BIO-RAD GelDoc 2000凝膠成像儀對膠進行觀察和分析。

1.2.4 椰子蛋白氨基酸組成分析

取一定量的椰子蛋白樣品于60 mL水解管中，加入20 mL 6 mol/L的HCl溶液，充氮封管，在105℃下水解24 h，取出、冷卻、開管，用去離子水無損轉移至25 mL容量瓶中，并定容。準確量取1 mL水解液于旋蒸瓶中，蒸干，加1 mL水再次蒸干，用0.02 moL/L的HCl復溶并定容至10 mL容量瓶中，待衍生，然后利用L-8900氨基酸分析儀測定椰子蛋白的氨基酸組成。

1.2.5 數據處理

實驗采用Excel 2010統計分析軟件進行數據整理、分析、作圖，顯著水平取P<0.05(差異顯著)，所有實驗數據均為平均值(n=3)。

2 結果與分析

2.1 清蛋白提取條件的確定

2.1.1 單因素實驗(見圖1～圖3)

圖1 液料比對清蛋白提取率的影響

圖2 提取溫度對清蛋白提取率的影響

圖3 提取時間對清蛋白提取率的影響

由圖1～圖3可見：清蛋白提取率隨著液料比的增加先逐漸增大后趨于平緩，最佳液料比為10∶1； 清蛋白提取率隨著提取溫度的升高呈現先增大后減小的趨勢，在50℃時達到最大值，這可能因為清蛋白超過50℃后發生了變性而凝聚[7]；清蛋白提取率隨著提取時間的延長先增大后趨于平緩。

2.1.2 正交實驗

根據單因素實驗結果，以液料比、提取溫度、提取時間為因素，以提取率為指標，采用正交實驗設計優化清蛋白提取工藝條件。清蛋白提取正交實驗設計及結果如表1所示。

由表1可知，影響椰子清蛋白提取率的因素大小順序為液料比>提取時間>提取溫度，液料比的影響最大，提取溫度影響最小。最佳提取工藝條件為A2B2C2,即液料比10∶1、提取時間4 h、提取溫度50℃，在此條件下清蛋白提取率為49.05%。

表1 清蛋白提取正交實驗設計及結果

2.2 球蛋白提取條件的確定

2.2.1 單因素實驗(見圖4～圖6)

圖4 液料比對球蛋白提取率的影響

圖5 提取溫度對球蛋白提取率的影響

圖6 提取時間對球蛋白提取率的影響

由圖4～圖6可見：球蛋白提取率隨著液料比的增大呈先增大后逐漸平緩的趨勢，在10∶1之前增加顯著；球蛋白提取率隨著提取溫度的升高先增大后減小，在50℃時達到最大；球蛋白提取率隨提取時間的延長先增加后減小，在4 h時達到最大。

2.2.2 正交實驗

根據單因素實驗結果，以液料比、提取溫度、提取時間為因素，以提取率為指標，采用正交實驗設計優化球蛋白提取工藝條件。球蛋白提取正交實驗設計及結果如表2所示。

表2 球蛋白提取正交實驗設計及結果

由表2可知，影響椰子球蛋白提取率的因素大小順序為液料比>提取溫度>提取時間，液料比的影響最大。最佳提取工藝條件為A2B2C2，即液料比10∶1、提取時間4 h、提取溫度50℃，在此條件下球蛋白提取率為46.65%。

2.3 醇溶蛋白提取條件的確定

2.3.1 單因素實驗(見圖7～圖10)

圖7 液料比對醇溶蛋白提取率的影響

圖8 提取溫度對醇溶蛋白提取率的影響

圖9 提取時間對醇溶蛋白提取率的影響

圖10 乙醇體積分數對醇溶蛋白提取率的影響

由圖7～圖10可見：隨著液料比的增加，醇溶蛋白提取率先增大，但增長趨緩，后稍微下降； 隨著提取溫度的升高，提取時間的延長，乙醇體積分數的增加，醇溶蛋白提取率均先增大后減少。醇溶蛋白主要由非極性氨基酸構成，乙醇中的羥基極性較強，可以增大溶解度，提取率上升[8]，隨著乙醇體積分數繼續增大，蛋白質發生變性，提取率降低。

2.3.2 正交實驗

根據單因素實驗結果，以液料比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數為因素，以提取率為指標，采用正交實驗設計優化醇溶蛋白提取工藝條件。醇溶蛋白提取正交實驗設計及結果如表3所示。

表3 醇溶蛋白提取正交實驗設計及結果

由表3可知，影響椰子醇溶蛋白提取率的因素大小順序為乙醇體積分數>提取時間>液料比>提取溫度。醇溶蛋白最佳提取工藝條件為A2B3C3D2，即液料比10∶1、提取時間5 h、提取溫度55℃、乙醇體積分數75%，在此條件下醇溶蛋白提取率為18.01%。

2.4 谷蛋白提取條件的確定

2.4.1 單因素實驗(見圖11～圖14)

圖11 液料比對谷蛋白提取率的影響

圖12 提取溫度對谷蛋白提取率的影響

圖13 提取時間對谷蛋白提取率的影響

圖14 堿溶pH對谷蛋白提取率的影響

由圖11～圖14可見：液料比在10∶1之前谷蛋白提取率隨液料比增加而顯著增加，隨后增長緩慢；隨著提取溫度的升高谷蛋白提取率先增大后減小，在50℃時達到最大值；隨提取時間的延長谷蛋白提取率先增加后降低，在5 h時達到最大值；谷蛋白提取率隨堿溶pH的增大先提高后降低，在pH 10時達到最大值。

2.4.2 正交實驗

根據單因素實驗結果，以堿溶pH、提取溫度、提取時間、液料比為因素，以提取率為指標，采用正交實驗設計優化谷蛋白提取工藝條件。谷蛋白提取正交實驗設計及結果如表4所示。

表4 谷蛋白提取正交實驗設計及結果

由表4可知，影響椰子谷蛋白提取率的因素大小順序為堿溶pH>提取溫度>提取時間>液料比，堿溶pH的影響最大。谷蛋白最佳提取工藝條件為A2B2C2D2，即堿溶pH 10、提取時間4 h、提取溫度50℃、液料比10∶1，在此條件下谷蛋白提取率為26.78%。

2.5 4種椰子蛋白的純度和占比

在優化的提取條件下，100 g脫脂椰子粉提取得到的4種蛋白的純度及占比見表5。

表5 4種椰子蛋白的純度及占比

由表5可以看出，從椰子蛋白中分離得到的清蛋白和球蛋白的質量明顯高于醇溶蛋白和谷蛋白的質量，二者占98.71%，球蛋白最多，占68.28%，清蛋白和球蛋白的純度也較高。這是因為清蛋白和球蛋白屬于可溶性蛋白，在水和鹽溶液中溶解比較完全，分離較徹底。

2.6 4種椰子蛋白的相對分子質量分布(見圖15)

從圖15可以看出：椰子清蛋白的SDS-PAGE譜圖主要有4條譜帶，其相對分子質量從上至下為152.4、104.9、77.5、58.2 kDa；球蛋白主要有2條譜帶，其相對分子質量從上至下為54.6、38.6 kDa；醇溶蛋白只有1條譜帶，其相對分子質量為21.6 kDa；谷蛋白主要有4條譜帶，相對分子質量從上至下為58.7、35.5、26.3、19.3 kDa。除了清蛋白有2條相對分子質量較大的譜帶外，其余3種蛋白相對分子質量都較小，小分子蛋白更有利于人體吸收。

注：a.Marker標準蛋白；b.清蛋白；c.球蛋白；d.醇溶蛋白；e.谷蛋白。

圖15 4種椰子蛋白的SDS-PAGE譜圖

2.7 椰子蛋白的氨基酸組成(見表6)

表6 3種椰子蛋白的氨基酸組成g/100 g

氨基酸清蛋白球蛋白谷蛋白異亮氨酸2.33.63.5亮氨酸3.26.16.1賴氨酸4.73.43.2蛋氨酸0.92.61.8苯丙氨酸2.26.34.3蘇氨酸2.93.72.9纈氨酸3.17.57.0組氨酸1.93.22.4酪氨酸4.13.12.9天冬氨酸6.59.39.1絲氨酸2.53.82.0谷氨酸19.816.913.7甘氨酸3.56.25.2丙氨酸3.43.93.3精氨酸17.314.712.8

由表6可知，3種椰子蛋白中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量明顯高于其他氨基酸，而蛋氨酸相對較缺乏。

3 結 論

(1)采用改良Osboren法對脫脂椰子粉進行分級提取得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，在單因素實驗基礎上，利用正交實驗優化，得到最佳提取工藝條件為：①在液料比10∶1、提取時間4 h、提取溫度50℃條件下，清蛋白提取率為49.05%，純度為57.1%；②在液料比10∶1、提取時間4 h、提取溫度50℃條件下，球蛋白提取率為46.65%，純度為70.8%；③在液料比10∶1、提取時間5 h、提取溫度55℃、乙醇體積分數75%條件下，醇溶蛋白提取率為18.01%，純度為32.7%；④在液料比10∶1、提取時間4 h、提取溫度50℃、堿溶pH 10條件下，谷蛋白提取率為26.78%，純度為70.4%。

(2)椰子清蛋白、球蛋白及谷蛋白的谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量明顯高于其他氨基酸，而蛋氨酸相對較缺乏。清蛋白電泳圖譜中有2條譜帶相對分子質量較大，其余3種蛋白相對分子質量都較小。整體來說椰子蛋白是較為優質的蛋白質。