米曲霉固態(tài)發(fā)酵程度對大豆拉絲蛋白特性的影響

柳 旺，蔣肇樣，賈冬英，張佳琪，姚 開

(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，成都 610065)

大豆拉絲蛋白(DSP)是以脫脂豆粕為主要原料，通過熱塑性擠壓形成的組織化高蛋白制品[1]，具有與肌肉纖維相似的黏彈性和咀嚼性，可以替代部分畜禽肉添加于肉制品(香腸、餃子餡等)中，也可直接加工成素食制品(素香腸、素火腿等)，提高其營養(yǎng)價值或改善其口感[2]。然而，由于DSP加工過程的高溫和高壓作用使其蛋白質(zhì)高度變性，導(dǎo)致其溶解度和再加工性較差，難以與其他物料有效復(fù)合，致使DSP應(yīng)用范圍受到一定的限制，其產(chǎn)品的市場接受度較低[3-4]。采用生物技術(shù)水解蛋白質(zhì)可以改變DSP的某些特性，如Kim等[5]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌發(fā)酵的DSP多肽含量提高了64倍，Lee等[6]發(fā)現(xiàn)蛋白酶水解的DSP溶解度提高了53.28%。米曲霉固態(tài)發(fā)酵釀造調(diào)味品過程中產(chǎn)酶效率高，且蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的水解產(chǎn)物可以較好地保留于產(chǎn)品中[7]。鑒于此，本文采用米曲霉固態(tài)發(fā)酵法處理DSP，研究了發(fā)酵程度對DSP特性的影響，分析了DSP水解度與持水性、溶解度、質(zhì)構(gòu)特性之間的相關(guān)性，以期為DSP某些加工特性的改善提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

米曲霉孢子，百惠生物科技有限公司；DSP，某食品有限公司；PDA培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限公司；ANS熒光探針，梯希愛上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

KDN-04A定氮儀，上海昕瑞儀器儀表有限公司；TA.XT.Plus物性測試儀，英國Stable Micro System公司；F-7000熒光分光光度計，日本HITACHI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備

取少量米曲霉孢子接入PDA培養(yǎng)基，30℃活化72 h，無菌生理鹽水洗下孢子，四層紗布過濾，血球計數(shù)板計數(shù)，無菌生理鹽水調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度為107個/mL。

1.2.2 DSP發(fā)酵

將DSP于室溫下復(fù)水至無硬芯，成型為5 mm厚片狀，隔水蒸制15 min，冷卻，擠壓，控制其含水量為70%，接種1%的米曲霉孢子懸浮液，混勻，30℃發(fā)酵一定時間。

1.2.3 檢測方法

1.2.3.1 水解度的測定

參照鄧露芳等[8]方法并略作修改。稱取2.00 g發(fā)酵樣品，充分研磨，加入100 mL去離子水，振蕩，5 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，加入60 mL去離子水，混勻，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至pH 8.2，加入pH 8.2甲醛溶液10 mL，室溫靜置3 min后用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至pH 9.2，記錄NaOH消耗量(V2，mL)；以未發(fā)酵的復(fù)水樣品作為空白對照(水解度為0)，記錄NaOH消耗量(V1，mL)。按下式計算樣品氨基酸態(tài)氮含量。

氨基酸態(tài)氮含量=(V2-V1)×0.1×20/2×0.014×100%

樣品總氮含量的測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》，按下式計算樣品水解度。

水解度=氨基酸態(tài)氮含量/總氮含量×100%

1.2.3.2 持水性的測定

定量稱取DSP發(fā)酵樣品(W1)，離心脫水(4 500 r/min)20 min，稱重(W2)。按下式計算樣品持水性。

持水性=W2/W1×100%

1.2.3.3 溶解度的測定

參照Shen等[9]方法并略作修改。稱取2.00 g發(fā)酵樣品，充分研磨，加入100 mL去離子水，磁力攪拌1 h，5 000 r/min離心10 min，按GB 5009.5—2016的方法測定上清液中氮含量。按下式計算樣品溶解度。

溶解度=上清液氮含量/樣品總氮含量×100%

1.2.3.4 表面疏水性的測定

參照Li等[10]的方法并略作改進(jìn)。用去離子水將1.2.3.1中上清液蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度稀釋至0.01～0.5 mg/mL，取4 mL不同蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的上清液，分別加入40 μL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(內(nèi)含8 mmol/L ANS，pH 7.0)，振蕩，室溫靜置3 min，然后進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測。熒光強(qiáng)度的檢測條件為：激發(fā)波長375 nm，發(fā)射波長494 nm。以熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度作圖，以其直線方程中斜率表示此水解度下DSP的表面疏水性。

1.2.3.5 質(zhì)構(gòu)特性的測定

樣品成型為20 mm×20 mm×5 mm片狀。DSP質(zhì)構(gòu)剖面分析(TPA)包括硬度、咀嚼性、彈性和內(nèi)聚性，其測定參數(shù)為：P/36R探頭兩次壓縮，間隔3 s，下壓距離15 mm，測前速度、測定速度和測后速度均為2.0 mm/s，下壓程度75%，觸發(fā)力5 g。組織化度測定參數(shù)為：HDP/BSW探頭，測前速度、測定速度和測后速度均為2.0 mm/s，下壓程度75%，用橫向剪切力與縱向剪切力的比值表征組織化程度。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

實驗平行重復(fù)3次，結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。采用Origin Pro 9.0軟件作圖、SPSS 17.0軟件分析差異顯著性和相關(guān)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵時間對DSP水解度的影響(見圖1)

圖1 發(fā)酵時間對DSP水解度的影響

由圖1可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，DSP的水解度增大，表明DSP可以被米曲霉分泌的蛋白酶水解，其水解度與發(fā)酵程度有關(guān)。當(dāng)發(fā)酵時間為84 h時，水解度為8.39%，此時DSP失去原有的組織化結(jié)構(gòu)，表明其水解過度。

2.2 水解度對DSP持水性的影響

持水性表現(xiàn)為DSP保持自身水分的能力，是蛋白質(zhì)與水相互作用能力的重要體現(xiàn)，持水性不僅與蛋白質(zhì)分子的大小和結(jié)構(gòu)有關(guān)，還受到蛋白質(zhì)交聯(lián)作用的影響[11]。水解度對DSP持水性的影響如圖2所示。

圖2 水解度對DSP持水性的影響

由圖2可以看出，隨著水解度的增加，DSP持水性先增加后降低，這是由于水解度的提高會減弱蛋白質(zhì)分子間的共價交聯(lián)作用，增大其分子間的空隙，有利于蛋白質(zhì)溶脹程度和截留水分子能力的提高，但過高的水解度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的空隙過大，對水的截留反而不利[12]。當(dāng)DSP的水解度為3.63%時，持水性最高(78.24%)，較之未發(fā)酵樣品提高了21.41%。

2.3 水解度對DSP溶解度的影響

溶解度是蛋白質(zhì)的重要特性之一，與其加工特性緊密相關(guān)。水解度對DSP溶解度的影響如圖3所示。

圖3 水解度對DSP溶解度的影響

由圖3可以看出，隨著水解度增大，DSP溶解度增加，這是由于DSP的水解會破壞其凝膠結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)分子親水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間相互排斥力增大[13]。當(dāng)水解度為3.63%時，溶解度較未發(fā)酵樣品提高了115.26%。

2.4 水解度對DSP表面疏水性的影響

DSP的疏水作用是維持凝膠結(jié)構(gòu)的重要作用力之一，且蛋白質(zhì)的表面疏水性是反映變性程度的重要指標(biāo)。水解度對DSP表面疏水性的影響如圖4所示。

圖4 水解度對DSP表面疏水性的影響

由圖4可以看出，隨著水解度增大，DSP表面疏水性下降，這是由于DSP的部分水解使其高級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，位于其結(jié)構(gòu)內(nèi)部的羧基和氨基等親水基團(tuán)暴露的緣故[14]。該結(jié)果進(jìn)一步佐證了米曲霉發(fā)酵水解DSP可在一定程度上改變其溶解性和持水性。

2.5 水解度對DSP質(zhì)構(gòu)特性的影響(見表1)

表1 水解度對DSP質(zhì)構(gòu)特性的影響

由表1可以看出，DSP硬度和咀嚼性隨水解度增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，硬度變化的原因是較低水解度時米曲霉菌絲的包裹作用使其硬度增大[15]，但過高的水解度會使其纖維化碎片增多，硬度降低。DSP的彈性表現(xiàn)出隨水解度增大逐漸減小的趨勢，這是由于其纖維化凝膠結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致了其恢復(fù)原有形狀的能力降低；內(nèi)聚性的變化趨勢與彈性相同，這是由于發(fā)酵后維持DSP凝膠結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子間疏水作用和二硫鍵受到破壞，導(dǎo)致其蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)對外力的抵抗作用降低[16]。當(dāng)水解度為3.63%時，DSP的硬度提高了13.04%，咀嚼性提高了20.00%，彈性和內(nèi)聚性分別降低了7.30%和13.33%。

2.6 水解度對DSP組織化度的影響

組織化度常用于表征DSP的纖維化程度。水解度對DSP組織化度的影響如圖5所示。

圖5 水解度對DSP組織化度的影響

由圖5可以看出，隨著水解度的增大，DSP組織化度逐漸降低，這是由于DSP纖維化凝膠結(jié)構(gòu)的破壞使其橫向剪切力的降低程度高于縱向剪切力[17]。當(dāng)水解度為3.63%時，組織化度降低了10.41%。

2.7 水解度與DSP特性的相關(guān)性

皮爾遜相關(guān)系數(shù)可以用來表征不同指標(biāo)之間的相關(guān)性。米曲霉發(fā)酵DSP的水解度與其特性之間的相關(guān)性見表2。

表2 水解度與DSP特性的相關(guān)系數(shù)

由表2可以看出，DSP水解度與溶解度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與彈性、內(nèi)聚性和組織化度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與持水性、硬度和咀嚼性無相關(guān)性。

3 結(jié) 論

采用米曲霉固態(tài)發(fā)酵法可以使DSP的特性發(fā)生某些變化，適宜水解度可以改善DSP的部分特性。當(dāng)水解度為3.63%時，其持水性、溶解度、硬度和咀嚼性分別提高了21.41%、115.26%、13.04%和20.00%，但其彈性、內(nèi)聚性和組織化度分別降低了7.30%、13.33%和10.41%。大豆拉絲蛋白的水解度與其溶解度呈極顯著正相關(guān)，與其彈性、內(nèi)聚性和組織化度呈極顯著負(fù)相關(guān)。