抑制EZH2表達對宮頸癌細胞凋亡的影響及機制

段繼惠，楊磊，穆紅，唐志琴

(天津市第一中心醫(yī)院，天津300190)

宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1,2]。鱗狀細胞癌是宮頸癌最常見的組織學類型[3]。病灶內(nèi)癌細胞的增殖和凋亡涉及多基因的異常表達，探討宮頸癌的分子調控機制以獲取有效的治療靶點，是改善宮頸癌患者預后的重要研究課題。人類Zest同源增強子(EZH2)基因是多梳家族(PcG)蛋白家族成員之一，它通過特異性地使基因啟動子區(qū)域組蛋白H3賴氨酸27發(fā)生甲基化，參與眾多基因的轉錄沉默。研究表明，EZH2在多種惡性腫瘤中表達水平增高[4,5]。在腫瘤生物學領域，為提高抗癌療效的特異性，分子靶向治療已引起廣泛關注。3-去氮腺嘌呤(DZNep)是一種能夠使染色體重塑的化合物，有研究表明，DZNep可以抑制EZH2的表達[6～8]。2017年10月～2018年6月，我們對宮頸癌細胞進行DZNep干預，觀察抑制EZH2表達對宮頸癌細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響，為以EZH2為靶點的宮頸癌治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料 根據(jù)本課題組前期研究所得Western blotting結果，選擇EZH2蛋白表達較高的人宮頸癌細胞系Siha和C33A細胞，Siha細胞由天津市第一中心醫(yī)院重點實驗室保存，C33A購自中國醫(yī)學科學院。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及胰酶購自美國Gibco公司；四甲基噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自天津萊博生物有限公司；Annexi Ⅴ細胞凋亡檢測試劑盒；Western blotting相關試劑及主要抗體購自上海碧云天生物有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) Siha和C33A細胞常規(guī)置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(加青霉素100 U/mL及鏈霉素100 μg/mL)，在37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶溶液消化，傳代，選用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 兩種細胞DZNep半數(shù)抑制濃度(IC50)值的確定 采用MTT法。將處于對數(shù)生長期的Siha和C33A細胞分別接種于96孔板。每孔細胞1×105個，培養(yǎng)12 h后分別加入梯度濃度的DZNep(0、0.2、0.6、1、2、4、6、8、10 μmol/L)，每個濃度設置3個復孔，另設對照孔(不加DZNep)和空白對照孔(DMEM+MTT+ DMSO)。細胞培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，全自動酶標儀讀取各孔吸光度值，波長設定為490 nm，實驗共重復3次。MTT結果顯示，隨著DZNEP濃度的增加，Siha和C33A細胞吸光度值均逐漸減小，有增殖活力的細胞數(shù)量逐漸減少，細胞的抑制率逐漸增加，Siha和C33A細胞的IC50分別為6 μmol/L和4 μmol/L，用于后續(xù)實驗。

1.4 細胞凋亡情況檢測 采用流式細胞儀。宮頸癌細胞株以5×105/孔的密度接種于6孔板，待細胞貼壁生長至瓶底的80%，于對數(shù)生長期時棄去原培養(yǎng)液，加入DZNep處理。分為DMSO組、1/2 IC50組和IC50組，分別以DZNep終濃度0、3、6 μmol/L處理Siha細胞各組，以0、2、4 μmol/L處理C33A細胞各組。培養(yǎng)48 h后收集各組細胞，PBS洗滌2次，用1×buffer重懸細胞，取100 μL細胞懸液加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和1 μL PI(100 mg/L)，室溫避光放置15 min，再加入400 μL 1×buffer，混勻后上機檢測細胞早期凋亡率。實驗重復3次，結果取平均值。

1.5 EZH2及相關凋亡蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測EZH2蛋白、抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-X基因長片段(Bcl-xL)、促凋亡蛋白Bcl-2家族細胞凋亡相互作用因子(Bim)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表達。將細胞分為DMSO組、1/2 IC50組和IC50組。取細胞培養(yǎng)懸液加入裂解液，提取細胞蛋白并進行定量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，分別用稀釋度1∶400的相應一抗 (EZH2、Bcl-xL、Bim、Caspase-3)，4 ℃過夜后加堿性磷酸酶(AP)標記的相應二抗IgG(1∶5 000)室溫下孵育120 min，以β -肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參分析目的蛋白的表達，利用增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯色條帶顯色，X線膠片曝光。實驗重復3次，Quantity One軟件計算吸光度積分值分析算出相應蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞早期凋亡率比較 在Siha、C33A細胞中，1/2 IC50組、IC50組早期凋亡率均高于DMSO組(P均<0.05)，IC50組早期凋亡率均高于1/2 IC50組(P均<0.05)。見表1、圖1。

2.2 Siha和C33A細胞中EZH2蛋白表達比較 在Siha、C33A細胞中，IC50組EZH2蛋白表達均低于1/2 IC50組、DMSO組(P均<0.05)。見表1、圖2。

2.3 Siha和C33A細胞中凋亡相關蛋白表達比較 在Siha、C33A細胞中，IC50組Bcl-xL蛋白表達均低于1/2 IC50組、DMSO組，Bim和Caspase-3蛋白表達均高于1/2 IC50組、DMSO組(P均<0.05)。見表2、圖2。

注：A和D為DMSO組；B和E為1/2 IC50組；C和F為IC50組。

表1 Siha、C33A細胞中各組細胞早期凋亡率及EZH2蛋白 表達比較

注：與DMSO組比較，*P<0.05；與1/2 IC50組比較，﹟P<0.05。

3 討論

EZH2是組成多梳蛋白抑制復合物多梳蛋白抑制復合體2(PRC2)的核心亞基，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能有重要作用[9,10]。近年研究顯示，EZH2在宮頸癌組織中異常高表達，抑制EZH2表達可延緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11,12]。探索以EZH2為靶點的基因治療是近年宮頸癌治療研究的方向之一。

表2 Siha、C33A細胞中凋亡相關蛋白表達比較

注：與DMSO組比較，*P<0.05；與1/2 IC50組比較，﹟P<0.05。

DZNep是3-脫氮腺苷類似物，它能誘導PRC2復合物包括EZH2的降解[13]。研究表明，DZNep具有抗腫瘤活性，對胃癌、前列腺癌、黑色素瘤中高表達的EZH2有明顯抑制作用[6,14,15]。EZH2是一種致癌基因，它可以特異性地使組蛋白H3的第27位點的賴氨酸(H3K27)三甲基化(H3K27me3)，從而使下游靶基因沉默，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。DZNep通過抑制組蛋白甲基轉移酶EZH2誘導腫瘤細胞的凋亡[16]。作為EZH2的小分子抑制劑，DZNep對腫瘤的潛在治療作用備受臨床醫(yī)生的關注。本研究結果顯示，在Siha、C33A細胞中，1/2 IC50組、IC50組早期凋亡率均高于DMSO組，提示DZNep能夠明顯促進Siha和C33A細胞的凋亡，濃度較高時抑制作用更強；在Siha、C33A細胞中，IC50組EZH2蛋白表達均低于1/2 IC50組、DMSO組，提示DZNep能夠明顯抑制EZH2蛋白的表達水平，而且DZNep的濃度越高，抑制作用越明顯。

抗凋亡是腫瘤細胞進展中普遍存在的特點，因此研究如何促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡可為治療腫瘤提供新的方向和靶點。凋亡信號的產(chǎn)生來自于細胞的不同部位，如線粒體、內(nèi)質網(wǎng)或細胞表面的死亡受體，最終由半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族的成員來完成，其中Caspase-3的活化是凋亡發(fā)生的重要標志[17]。Bcl-xL屬于Bcl-2家族成員，通過阻止線粒體外膜上Bax/Bak寡聚體的形成來發(fā)揮其抗凋亡作用[18]；而Bcl-2家族的另一成員Bim的作用與Bcl-xL的功能截然相反[19]，具有促凋亡的作用。Bim只含有BH3結構域，它是線粒體凋亡的始動者，受到轉錄和翻譯后兩個水平的調節(jié)。活化的Bim分子移位到線粒體膜，使線粒體外膜上的Bax/Bak活化，膜通透性發(fā)生改變，形成凋亡小體，導致細胞凋亡。本研究結果顯示，在Siha、C33A細胞中，IC50組Bcl-xL蛋白表達均低于1/2 IC50組、DMSO組，Bim和Caspase-3蛋白表達均高于1/2 IC50組、DMSO組，提示DZNep可使宮頸癌細胞中Bcl-xL表達降低，而使Bim和Caspase-3蛋白表達增高，結合本研究所得細胞凋亡率結果，考慮DZNep可以通過抑制EZH2的表達，進而下調抗凋亡蛋白Bcl-xL表達并上調促凋亡蛋白Bim、Caspase-3表達，從而促進宮頸癌細胞凋亡。

注：A和D為 DMSO組；B和E為1/2 IC50組；C和F為IC50組。

本研究結果表明，利用DZNep靶向下調宮頸癌細胞系Siha和C33A中EZH2的表達后，能夠誘導宮頸癌細胞早期凋亡，其機制可能與抑制EZH2的表達，進而下調Bcl-xL蛋白表達并上調Bim和Caspase-3蛋白表達有關，為后續(xù)動物實驗和臨床應用提供了實驗依據(jù)。