HPLC法測定民族藥露水草中β-蛻皮激素的含量

楊勇幫 李媛媛 李繼琪

摘要：目的?露水草中β-蛻皮激素的含量測定。方法?采用高效液相法對露水草中β-蛻皮激素含量進(jìn)行測定。色譜柱為Agilent Extend-C18柱（4.6×150 mm，粒徑5 μm）;流動相為甲醇-水（40：60）;柱溫35℃;檢測波長248 nm;流速1.00 mL/min;進(jìn)樣量5 μL。結(jié)果?β-蛻皮甾酮溶液在0.025 mg/mL～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.9999）。平均回收率為102.02%（n=6），RSD值為1.0%。結(jié)論?本方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，精密度高，適用于β-蛻皮甾酮的含量測定。

關(guān)鍵詞：β-蛻皮甾酮;高效液相色譜法（DAD UV檢測器）;含量測定

中圖分類號：R927.2?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：1007-2349（2019）03-0070-05

20-羥基蛻皮甾酮（20-Hydroxy ecdysterone）又稱β-蛻皮激素（β-ecdysone），是一種昆蟲的變態(tài)激素，可用于防治害蟲及提高蝦蟹產(chǎn)量[1]。化學(xué)式為C27H44O7[2]。其不僅能促進(jìn)昆蟲變態(tài)，還具有很多藥理活性[3]。具有促進(jìn)細(xì)胞生長、刺激真皮細(xì)胞分裂、產(chǎn)生新的生命細(xì)胞和生殖細(xì)胞的作用[4]。還可促進(jìn)動物的生長發(fā)育，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪代謝，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肝臟等功效[5]。其主要作用是促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的合成，影響糖代謝和脂類代謝，免疫調(diào)節(jié)機(jī)體。高劑量的蛻皮激素能擾亂昆蟲體內(nèi)的正常代謝過程，所以用于防治害蟲[6]。在運(yùn)動保健方面，β-蛻皮激素具有顯著的通過增加氨基酸裝配成蛋白鏈，從而刺激肌肉細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)合成的能力，而且該能力回溯至蛋白質(zhì)生長的轉(zhuǎn)譯和轉(zhuǎn)移的過程[7]。蛻皮甾酮類甾體化合物廣泛的存在于不同科屬的植物中[8]。迄今為止，露水草是昆明植物所聶瑞麟先生發(fā)現(xiàn)的自然界中含植物甾酮類成分最豐富的藥用植物之一[9]。本次實(shí)驗(yàn)選用露水草為提取原料。露水草（Cyanotis C.B.Clark）又名珍珠露水草、換肺散、雞冠參等，為鴨跖草科（Commelinacede）藍(lán)耳草屬多年生宿根性草本，分布于中國、印度、斯里蘭卡及中南半島，我國主要分布于云南、貴州、廣西、廣東、福建、臺灣等省（區(qū)）海拔1100～1700 m的山溝、山坡林緣或林中[10]。

綜合實(shí)驗(yàn)室條件等各種原因，此次試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）測定β-蛻皮激素的含量。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?梅特勒托利多萬分之一電子天平（型號 MS204）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（型號 101-0EBS）;超聲清洗儀器（型號 CPXS800H-C）;安捷倫高效液相色譜儀（型號 1260 DAD UV檢測器）。

1.2?試藥?露水草全草干草;β-蛻皮甾酮對照品（批號：111638-201304，含量以按95.8%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院）;乙腈、甲醇（色譜純）;其他化學(xué)試劑為分析純;水為超純水。

2?方法條件的選擇與結(jié)果

2.1?檢測波長的確定?精密稱取β-蛻皮甾酮對照品26.10 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶，搖勻，即得濃度為每1 mL含β-蛻皮甾酮0.5001 mg的對照品貯備液。精密吸取上述溶液3 mL置50 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（濃度為30 μg/mL）。取樣品0.2 g至50 mL容量瓶，加甲醇25 mL，超聲40 min，取出，放冷至室溫，定容至刻度，作為供試品溶液。取上述供試品溶液及對照品溶液，在乙腈-水（15：85）、乙腈-甲醇-水（14：28：58）、甲醇-水（40：60）三種流動相中分別進(jìn)樣，DAD UV HPLC色譜儀在波長200～600 nm掃描，得出最大吸收波長。結(jié)果顯示對照品溶液及供試品溶液均在λ=248 nm處有最大吸收，且無雜峰干擾，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測波長確定為248 nm。

2.2?色譜柱的選擇?選用4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm色譜柱測量時，保留時間接近半小時，用時過長，且保留時間波動較大，峰面積不穩(wěn)定，所以選擇4.6 mm×150 mm，粒徑5 μm色譜柱，短柱保留時間在5 min左右，相比之下，縮短了試驗(yàn)時間，且峰面積與長柱相比較穩(wěn)定。選擇出4.6 mm×150mm色譜柱。

2.3?樣品提取方法的選擇?本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取40 min、振蕩提取40 min及索式提取至無色三種方式進(jìn)行提取，結(jié)果顯示采用索式提取β-蛻皮甾酮含量相對較高;但預(yù)實(shí)驗(yàn)時索式提取四份樣品精密度較差，提取近14 h才至無色比較費(fèi)時且存在溫度難控等因素，相較于超聲及振蕩提取，β-蛻皮甾酮含量相近，但考慮到操作性，最終采用超聲提取。

2.4?提取溶劑的確定?本實(shí)驗(yàn)采用甲醇、乙醇兩種溶劑通過超聲提取40 min、振蕩提取40 min及索式提取至無色三種提取方式提取，三種提取方式結(jié)果都顯示甲醇溶劑提取時含量相對較高，最終確定采用甲醇溶劑提取。

2.5?流動相的確定?預(yù)實(shí)驗(yàn)時標(biāo)準(zhǔn)品以及三種方法提取所得的樣品都分別在檢測波長248 nm，三種流動相乙腈-水（15：85）[11]、乙腈-甲醇-水（14：28：58）、甲醇-水（40：60）[11]條件下進(jìn)樣。通過對比保留時間、色譜吸收峰峰型以及峰面積，乙腈-水（15：85）為流動相時出峰時間相對另外兩種較長;乙腈-甲醇-水（14：28：58）為流動相時分離度達(dá)不到要求;甲醇-水（40：60）為流動相時保留時間相對較短，峰形較好，峰面積較穩(wěn)定，所以確定以甲醇-水（40：60）為流動相。

2.6?柱溫的確定?試驗(yàn)期間，環(huán)境溫度的變化對保留時間影響較大，不同的環(huán)境溫度會導(dǎo)致保留時間的波動。溫度降低時，保留時間提前，溫度升高時保留時間往后延，最大與最小保留時間相差超過0.5 min，所以將柱溫從30 ℃調(diào)為35 ℃，且保持進(jìn)樣過程中環(huán)境溫度波動較小，此條件下進(jìn)樣，保留時間仍有變化，但在0.4 min范圍內(nèi)，峰面積變化有較大改觀。

3?溶液的配制

3.1?樣品溶液?樣品前處理：將露水草植物樣品打粉后過3號篩（50目），備用。取露水草樣品0.2 g至50 mL容量瓶，加甲醇25 mL，超聲40 min，取出，放冷，定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

3.2?標(biāo)準(zhǔn)品溶液

3.2.1?濃度為0.5000mg/mL對照品溶液?精密稱取β-蛻皮甾酮對照品26.10 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶，搖勻，即得濃度為每1 mL含β-蛻皮甾酮0.5001 mg的對照品貯備液。

3.2.2?濃度為0.2000mg/mL對照品溶液?精密稱取β-蛻皮甾酮對照品41.75 mg，甲醇定容至200 mL量瓶，得0.2000 mg/mL對照品溶液。

3.3?陰性對照溶液?取不含β-蛻皮甾酮的空白樣品，照供試品溶液制備方法制備，即得陰性對照溶液。

4?色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，粒徑5 μm），柱溫：35 ℃;流動相：甲醇-水（40：60）;流速1 mL/min;進(jìn)樣量5μL;檢測波長：248nm。

5?檢測方法及結(jié)果

5.1?專屬性考察?按照上述色譜條件，分別吸取三（一）、（二）、（三）項(xiàng)下溶液即供試品溶液、對照品溶液陰性對照溶液，各5 μL注入色譜柱，采集色譜圖。

陰性對照品色譜在對照品出峰位置上無干擾峰，即本實(shí)驗(yàn)條件下對測定干擾較小，系統(tǒng)誤差較小。對照品圖譜β-蛻皮甾酮（Rt=5.166 min）。樣品圖譜β-蛻皮甾酮（Rt=5.091 min），且它們的分離效果都良好。

5.2?線性范圍考察?取三.（二）.1中0.5001 mg/mL的對照品貯備液，精密量取8 mL置10 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，照此方法依次稀釋，得到濃度為0.400 mg/mL、0.300 mg/mL、0.200 mg/mL、0.100 mg/mL、0.050 mg/mL、0.025 mg/mL對照品溶液。吸取上述各濃度的對照品溶液及0.5001 mg/mL的對照品溶液分別進(jìn)樣5 μL;按上述色譜條件測定峰面積，每個濃度各進(jìn)樣2針。結(jié)果見表1。

以β-蛻皮甾酮濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，平均峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。線性回歸方程為：y=7569x+9.858，r=0.9999（x：mg/mL），結(jié)果表明，在0.025 mg/mL～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

5.3?重復(fù)性?按3.1項(xiàng)下操作，平行配制6份供試品溶液，按上述色譜條件測定，每份進(jìn)樣2次。結(jié)果β-蛻皮甾酮的峰面積無顯著差異，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.4%（RSD值<2%），表明該方法重復(fù)性良好，結(jié)果見表2。

5.4?精密度?按3.2.1項(xiàng)下操作分別配制兩份濃度為0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，每份重復(fù)進(jìn)樣5次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD值分別為0.2%和0.3%，小于2%，故本實(shí)驗(yàn)的精密度滿足要求的規(guī)定。結(jié)果見表3。

5.5?穩(wěn)定性?取同一供試品溶液按上述色譜條件在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h進(jìn)樣5 μL，測定峰面積及RSD，結(jié)果峰面積變化不大，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.6%，小于2%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)沒有明顯的變化是穩(wěn)定的。結(jié)果見表4。

5.6?樣品含量測定?按3.1項(xiàng)下操作制備供試品溶液3份，按上述色譜條件測定，每份進(jìn)樣2次，計(jì)算含量（本品含量按干燥品計(jì)算）結(jié)果如表5。

5.7?加樣回收率試驗(yàn)?精密稱取已知含量的露水草樣品6份（每份約取0.1 g），再分別精密加入3.2.2項(xiàng)下對照品溶液25 mL，超聲40 min，取出，放冷，定容至刻度，搖勻，濾過，按上述色譜條件測定，每份進(jìn)樣2次，測得回收率介于100.0%～105.0%之間，RSD值為1.0%（<2%），表明回收率良好，結(jié)果見表6。

6?結(jié)論

本試驗(yàn)采用DAD UV HPLC色譜法測定樣品中β-蛻皮甾酮的含量，本檢驗(yàn)方法得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相關(guān)系數(shù)為0.9999，精密度的RSD值小于2%，重復(fù)性的RSD值0.4%，樣品含量為0.0543g/g，加標(biāo)回收率在100.0%～105.0%間。該方法適用于β-蛻皮甾酮的含量測定

7?討論

7.1?檢測波長的確定?測定進(jìn)行前，吸收波長的選擇至關(guān)重要。為確定β-蛻皮甾酮含量測定的檢測波長，通過DAD UV高效液相色譜儀及紫外可見分光光度計(jì)掃描確定。紫外可見分光光度計(jì)檢測以甲醇為空白對照，取對照品溶液及供試品溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果對照品溶液在240 nm處有最大吸收波長，供試品在248 nm處有最大吸收;DAD UV高效液相色譜儀測定時在200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果對照品溶液及供試品溶液均在248 nm處有最大吸收。此時存在差異，但由于時間原因及本實(shí)驗(yàn)是采用DAD UV高效液相色譜儀進(jìn)行測定，故測定波長定為248 nm。在此也希望以后有機(jī)會能對此問題做進(jìn)一步研究。

7.2?樣品提取?樣品提取時，結(jié)果顯示采用索式提取時，β-蛻皮甾酮含量相對較高，但提取期間，有超過10 h的提取時間間隔，可能會對測定結(jié)果造成影響。待提取劑回流至無色后，冷卻裝置過程中，提取管中提取劑又有顏色出現(xiàn)，對提取時間的確定有影響。由于存在多方面影響提取β-蛻皮甾酮的因素，排除此種提取方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱國棟，張易祥，葉金云，等.露水草加工粒徑和其β-蛻皮激素釋放的關(guān)系[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（29）：17760-17761.

[2]唐博志，李龍，武國華.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定家蠶血液中β-蛻皮激素[J].質(zhì)譜學(xué)報，2015，36（1）：52-58.

[3]楊奮有，張俊權(quán)，趙忠，等.β-蛻皮激素對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥藥理與臨床，2001（6）：17.

[4]范作卿，鄒德慶.高效液相色譜法測定柞蠶雄蛾?duì)I養(yǎng)液中β-蛻皮激素含量[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44（5）：114-115.

[5]宋昆，劉軍，廖森泰，鄒宇曉，等.家蠶雄蛾中睪酮和β-蛻皮激素的聯(lián)合提取及含量測定[J].蠶業(yè)科學(xué)，2015，41（6）：1083-1087.

[6]徐慧.高效液相色譜法測定藍(lán)耳草中β-蛻皮激素含量[J].廣西科學(xué)院學(xué)報，2010，26（3）：239-241.

[7]郭菊玲，楊勇幫，趙玉梅.彝藥露水草中β-蛻皮激素的提取工藝研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2017，38（7）：70-73.

[8]王錦亮，阮德春，程治英，等.露水草中20-羥基蛻皮甾酮的動態(tài)變化[J].云南植物研究，1996（4）：99-104.

[9]譚成玉，孔亮，李銑，等.云南露水草中的一種新植物甾酮的分離與分析[J].色譜，2011，29（9）：937-941.

[10]牟蘭，楊生超，關(guān)德軍，等.露水草β-蛻皮激素含量積累規(guī)律與最佳采收期研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，26（2）：194-198+204.

[11]惠玉虎，張立，李健.RP-HPLC法測定珍珠露水草提取物中蛻皮激素的含量[J].中草藥，2002（5）：45.