埃博拉病毒分子生物學研究進展

孫英堯，董 浩

(吉林農業(yè)大學生命科學學院，長春 130118)

埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)是一種十分罕見的病毒，它是在1976年同時暴發(fā)的兩起疫情中首次出現(xiàn)的，一起在現(xiàn)在的南蘇丹恩扎拉，另一起在剛果民主共和國揚布庫。后者發(fā)生在位于埃博拉河附近的一處村莊，該病由此得名。感染埃博拉出血熱(Ebola virus disease, EVD)通常潛伏期為4～10 d，初期癥狀與流感類似，表現(xiàn)為嘔吐與腹瀉，隨后身體內外出血，伴隨有突發(fā)休克，最后是多器官衰竭。病人一般在出現(xiàn)癥狀后的6～16 d死亡。盡管目前已研發(fā)了一些疫苗可對埃博拉病毒進行防護，但我們對埃博拉病毒的了解還不夠。本文就埃博拉病毒的分子生物學研究進展作一綜述，以期為更深入的研究提供參考。

1 埃博拉病毒的分類學地位

埃博拉病毒屬于單股反意病毒目(Mononegavirales)絲狀病毒科(Filoviridae)埃博拉病毒屬(Ebolavirus)。該屬又包含5個種：本迪布焦埃博拉病毒(BundibugyoEbolavirus，BEBOV)、雷斯頓埃博拉病毒(RestonEbolavirus，REBOV)、蘇丹埃博拉病毒(SudanEbolavirus，SEBOV)、大森林型埃博拉病毒(TaiForestEbolavirus；IvoryCoastEbolavirus，ICEBOV)、扎伊爾型埃博拉病毒(ZaireEbolavirus，ZEBOV)。絲狀病毒科下還有兩個屬，為馬爾堡病毒(Marburgvirus，MAEV)與奎瓦病毒(Cuevavirus)[1]。

2 埃博拉病毒分子生物學研究進展

埃博拉病毒(圖1)直徑80 nm，長度為970～1200 nm，進入細胞后病毒的長度可達14000 nm[2]。埃博拉病毒的反意基因長達19 kb，基因組呈線狀，無分段，包含有7個基因與兩個調節(jié)區(qū)段。兩個調節(jié)區(qū)段位于3’頭端與5’尾端。3’頭端有雙向復制的啟動子，也是第一個基因的轉錄起始位點。5’尾端編碼復制啟動子的互補序列[3]。7個基因分別對應編碼埃博拉病毒的7種病毒蛋白，分別為：核蛋白(nucleoprotein，NP)、糖蛋白(glycoprotein，GP)、L聚合酶蛋白(L-polymerase protein，L)、病毒蛋白24(viral protein24，VP24)、病毒蛋白30(viral protein30，VP30)、病毒蛋白35(viral protein35，VP35)與病毒蛋白40(viral protein40，VP40)[4]。7種蛋白的分子生物學特征綜述如下：

圖1 埃博拉病毒電鏡照片[5]Fig 1 Electron microscope photography of Ebola virus[5]

2.1 病毒蛋白24(VP24) VP24是絲狀病毒的常見蛋白。以往的研究表明，該蛋白的功能是抑制宿主機體產生α、β與γ干擾素，阻礙干擾素基因的翻譯過程。VP24能夠通過結合真核細胞核孔的核轉運蛋白以及抑制KappaB(NF-KB)通路來阻止編碼干擾素基因的轉錄、信號轉導與磷酸化過程[6]。

VP24也是病毒組裝衣殼的重要蛋白，它增強了不同結構蛋白之間的協(xié)同催化作用。通過觀察C、N末端缺失的VP24，發(fā)現(xiàn)N末端編碼的VP24具有調控衣殼蛋白形成的作用[7]，說明VP24在病毒衣殼合成過程中起的作用應該為催化作用或者為調控VP35與NP。另有研究表明，VP24與VP40的共同表達能夠形成大量的類病毒粒子(VLPs)，遠比VP40單獨表達時多得多，推測可能是VP24的小干擾RNA(siRNA)降低了病毒的釋放量，使大量的病毒蛋白保留在被感染的細胞內。此外還有研究表明，VP24結合在VP35的病毒衣殼外表面，起到了調節(jié)NP層、增強衣殼機械強度穩(wěn)定性的作用，增強了NP、VP35、VP24的協(xié)同關系[8]。

2.2 病毒蛋白35(VP35) VP35的主要作用是影響宿主的免疫系統(tǒng)，使病毒免于被宿主的免疫機制清除。VP35是1型干擾素的拮抗物，通過與雙鏈RNA結合抑制干擾素調節(jié)因子3，同時抑制1型干擾素RIG-1的信號傳導從而降低α型與β型干擾素的生成[9]。VP35還能通過多種途徑影響宿主整體的免疫系統(tǒng)。VP35通過增加活躍的STAT1(轉錄活化蛋白1)調節(jié)干擾素調節(jié)因子7的活性，抑制干擾素生成toll樣受體與RIG-1的活性。已有證據(jù)表明，VP35還可以解除RNA沉默，可以使先天免疫信號傳導與宿主的抗病毒反應失效[10]。

此外，VP35也有協(xié)助病毒復制的功能。VP35的C末端可以結合雙鏈RNA，而N末端可以結合NP。當VP35的N末端與NP解離時，NP會活化，隨后與病毒RNA結合，高度激活基因組的轉錄活性，隨后的NP解離，并出現(xiàn)寡聚現(xiàn)象，形成寡聚NP。但NP單體并沒有寡聚的傾向，僅在上述的生化反應中才會出現(xiàn)寡聚。此外，其他病毒中VP35與NP的作用反而會降低NP的寡聚化。對這一現(xiàn)象的研究可能是研發(fā)治療埃博拉出血熱的突破口。

2.3 病毒蛋白30(VP30) VP30是埃博拉病毒的一種次要核蛋白質，主要作用是起始病毒基因組的轉錄，并調節(jié)細胞的動態(tài)磷酸化過程[11]。最新的報道發(fā)現(xiàn)，VP30還具有解除RNA干擾的功能，但是具體機制尚不明確。當存在siRNA時，VP30會影響主要參與RNA干擾的蛋白的帽子結構，這時即使是VP35的N末端RNA結合域已經(jīng)結合，但VP30的干涉仍會啟動。這表明VP30蛋白的RNA結合功能非常廣泛，而且不止限定于宿主或者病毒自身的RNA，似乎存在一定的堿基結構選擇性，但是這一功能是否為病毒RNA轉錄所必須的，目前尚不可知。

2.4 病毒蛋白40(VP40) VP40是病毒組裝的基石[12]，其主要作用是形成六聚物——這一結構被認為是埃博拉病毒衣殼的基礎結構，功能為埃博拉基因組復制與RNA的結合[13]。

以往的研究多針對于該蛋白作用調節(jié)生成VLPs，而最近的研究表明，VP40還可以產生外泌體結構，殺死免疫細胞。外泌體的出現(xiàn)一般是在病毒感染細胞之后， VP40導致的外泌體接觸到未成熟的T細胞和單核白血球細胞后，會引起這兩者的凋亡及活性下降。關于VP40在致病機制中的作用，有可能是開發(fā)新治療手段的切入點。已有研究用酪氨酸磷酸激酶對其進行酪氨酸殘基加聚磷酸基團，降低VP40的活性。還有使用氧四環(huán)素作為其他治療手段[4]，它可以導致VP40相關的分泌小體減少，并顯著降低接受了分泌小體的受體細胞的生存能力，這一成果對治療埃博拉出血熱有著很大的研發(fā)空間。

2.5 糖蛋白(GP) GP是埃博拉病毒蛋白中最主要的毒性蛋白。GP并非指單獨的GP糖蛋白，而是由編碼GP基因經(jīng)過轉錄編輯形成的三種產物的總稱：其包括全長的GP蛋白(包含GP1受體結合域，GP2病毒融合域兩個亞基)；可溶性GP(sGP，缺少橫跨膜域)與小可溶GP(ssGP)。sGP上存在福林酶位點，經(jīng)過福林酶處理后的sGP可以產生一個碎片片段稱為△-肽[14]。

GP與病毒感染細胞的途徑密切相關。通過GP介導的胞飲作用，GP會將病毒與宿主細胞的前溶酶體結構相融合，促使病毒進入細胞。在毒性方面，GP通過黏蛋白類似域影響細胞的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，降低了ERK2的磷酸化作用與催化活性，降低宿主細胞的粘附性，使細胞剝離且不能維持正常的球形，繼而使細胞死亡[15]。此外，sGP的碎片產物△-肽有可能還扮演著埃博拉病毒致病機理中病毒孔蛋白的作用，其可以在哺乳動物的原生質膜上形成孔道，增加離子通透性，破壞細胞的內環(huán)境平衡[16]。

GP作為位于病毒衣殼表面的蛋白，與埃博拉病毒的侵染選擇性也有很深的淵源。在2014-2016年的西非埃博拉出血熱爆發(fā)中，檢測到的埃博拉病毒的GP蛋白在A82V中的高頻變異。這一變異增加了GP的膜融合活性，并且使得大量其他型的細胞變得可以被侵染：包括黑猩猩的纖維母細胞(S008842)、恒河猴上皮細胞(FRhK4)、非洲綠猴上皮細胞(Vero)以及人樹突細胞。這一信息表明新種埃博拉病毒已經(jīng)開始高度適應人類作為宿主[17-18]。

2.6 核蛋白(NP) NP是埃博拉病毒的復制循環(huán)中的重要蛋白——核糖核蛋白復合物的亞基，其主要功能是保護病毒RNA免于被降解，保證病毒基因組在裝配過程中正確進入到病毒粒子的衣殼中。目前NP的新功能并沒有發(fā)現(xiàn)。

2.7 聚合酶蛋白(L) L是依賴RNA的RNA聚合酶，是病毒多聚酶復合物的元件之一。主要功能是病毒的轉錄與復制過程中對病毒RNA進行反轉錄與翻譯，但是L作為一種病毒的RNA聚合酶，其功能與真核細胞的RNA聚合酶差異很大。以GP基因為例子，L將其翻譯的結果是sGP而不是GP[19]。L的翻譯也是實現(xiàn)調節(jié)GP、sGP、ssGP不同水平的原因。在連續(xù)培養(yǎng)的組織細胞中，L被發(fā)現(xiàn)能夠在GP基因中連續(xù)的7個U中再添加一個U，從而調節(jié)GP與sGP的表達比率為80∶20。在豚鼠的實驗中，該基因回復突變再次使這個基因又變回了7個U，導致GP∶sGP=20∶80[20]。這一特點有可能是病毒進行免疫回避的一種獨特手段。作為對比，在人的肝癌細胞系(Hun7)中的病毒復制則是一個該基因為9U的變異體，其保持了高水平的sGP表達，同時增強的還有ssGP的表達。通過豚鼠與人肝癌細胞的兩個實驗中不難發(fā)現(xiàn)L除了翻譯的功能之外，還存在有調節(jié)GP與GP相關蛋白比例的功能。這一現(xiàn)象據(jù)推測可能與病毒為了適應不同的宿主而進行的調節(jié)有關，從而實現(xiàn)在宿主體內的快速復制。

3 結 語

埃博拉出血熱目前尚無有效的治療手段。對埃博拉疫苗的研究始于2004年，由美國衛(wèi)生與公眾服務部(State Department of Health and Human Services)發(fā)起的Project Bioshield，最終于2014年推出了能夠100%保護的疫苗，這為后來的埃博拉病毒疫苗提供了模板。隨后的口腔炎病毒(rVSV)與扎伊爾埃博拉病毒(ZEBOV)糖蛋白的重組病毒(rVSV-ZEBOV)疫苗在2016年的埃博拉疫情中效果顯著，但是仍然有患者在痊愈后1～2年中抗體顯著下降，有著復發(fā)的潛在危險[21]。目前來看，針對于埃博拉出血熱的疫苗開發(fā)形式仍然嚴峻。