女貞子多糖對仔豬抗氧化及MAPK通路的影響

朱 琪，梁世岳，魯 森，趙 駿，李玉鵬，喬家運,2，李海花

(1.天津大學化工學院，天津 300350；2.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300381；3.天津大學理學院化學系，天津 300072； 4.天津中醫藥大學中藥學院，天津 301617；5.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300384)

仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌及其內毒素引起的，給中國乃至世界范圍內養豬業造成巨大損失[1]。仔豬斷奶應激由多種原因引起，其中大腸桿菌病繼發感染導致腹瀉是仔豬死亡的重要原因，本課題組前期研究發現人工感染大腸桿菌可以引起仔豬氧化損傷，并激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路[2]。飼料中添加女貞子可以提高斷奶仔豬生長性能，免疫功能和抗氧化能力[3]。女貞子多糖是女貞子的重要有效成分，具有促進仔豬生長、調節免疫、防病和抗氧化應激等多重功效[4]。本研究通過在飼料中添加女貞子多糖飼喂斷奶仔豬，口服大腸桿菌K88攻毒后，檢測血清和肝腎組織中的氧化應激相關因子，并評價肝臟組織MAPK信號通路關鍵蛋白的轉錄水平，來分析女貞子多糖抗仔豬感染大腸桿菌病的分子機制，為臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及分組 選取體重接近(7.93±1.36)kg，(21±2)日齡，健康三元雜交斷奶仔豬“杜×長×大”20頭。

1.1.2 女貞子多糖的制備 根據水提醇沉法進行女貞子多糖的提取。取200 g炙女貞子于70 ℃烘箱中，3 h后將烘干的女貞子倒入粉碎機粉碎，過40目篩。稱40 g女貞子粉放于320 mL蒸餾水中在100 ℃中加熱回流2 h，用真空泵抽濾。把分離出的水溶液，用旋轉蒸發儀脫除水分濃縮，濃縮到3 g/mL時停止，此時加入一定量乙醇(約67 mL)，使乙醇體積分數占比達到70%，再用玻璃棒進行攪拌15 min后靜置6 h。最后真空泵抽濾析出沉淀，抽濾得到的濾餅為女貞子多糖，最后放于烘箱中烘干，稱重得4.1 g女貞子多糖，得糖率為10.25%[5]。用此方法共制得200 g女貞子多糖用于后續試驗，制備工作在天津大學理學院和天津中醫藥大學中藥學院共同完成。

1.1.3 試驗日糧及飼養管理 斷奶仔豬20頭，每頭仔豬為單籠飼養，隨機分為4組，每組5頭仔豬，標記為對照組、大腸桿菌組、女貞子多糖組和大腸桿菌+女貞子多糖組，。對照組和大腸桿菌組飼喂基礎飼糧，女貞子多糖組和大腸桿菌+女貞子多糖組飼喂基礎日糧中添加了0.1%的女貞子多糖的飼糧。試驗為期15 d，每頭仔豬為單籠飼養，自由飲水和采食，濕度為55%～70%，溫度為25～28 ℃。在試驗進行到第14天時斷料不斷水，大腸桿菌組和大腸桿菌+女貞子多糖組攻毒大腸桿菌。24 h后所有仔豬進行采血，分離血清進行檢測。隨后屠宰仔豬采取肝臟和腎臟，用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行沖洗，并迅速放到液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 仔豬大腸桿菌病模型的建立 在飼養第14天時，口服大腸桿菌K88菌液1 mL/kg(菌液濃度為2×109CFU/mL)，菌種為實驗室前期保存，具體操作方法參照文獻[5]，通過臨床診斷，血常規和血清生化指標作為仔豬大腸桿菌病的判定標準，在24 h內記錄仔豬的發病情況，24 h后采血剖檢采樣。

1.2.2 血清及肝、腎氧化指標檢測 血清丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、和過氧化氫酶(CAT)都采用的是比色的方法進行測定，仔豬屠宰后剖檢，無菌采集肝臟和腎臟組織，2 h內測定肝臟、腎臟的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，并嚴格按照試劑盒使用說明進行操作。

1.2.3 引物設計與合成 基因序列的引物是由上海生工工程(北京)技術服務有限公司設計合成。基因名稱及引物序列見表1。

表1 氧化應激相關基因引物序列Tab 1 Oxidative stress related gene primer sequences

1.2.4 斷奶仔豬肝臟相關基因的檢測

綜合以上內容，陶瓷與酒的結合在歷史上由來已久，對于現代酒類包裝設計工作的展開來說，設計人員必須能在確保陶瓷這一傳統文化元素發揮出自身作用的同時，保證酒類產品外包裝設計的創新性。

1.2.4.1 總RNA的提取和反轉錄 樣品處理：首先稱重研磨管并記錄，采取各組肝臟分別放于研磨管中，稱重記錄。RNA提取：使用DNA/RNA Extraction Kit(金瑞鴻捷生物科技有限公司)試劑盒進行提取。反轉錄：使用All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit(廣州易錦生物技術有限公司)試劑盒。

1.2.4.2 實時熒光定量PCR 使用All-in-OneTMqPCR Mix(廣州易錦生物技術有限公司)試劑盒，加樣、離心、振蕩、離心，然后把8連管放入到熒光定量PCR儀中。反應程序為：預變性95 ℃，10 min；40個循環；溶解曲線分析。

1.3 統計分析 Excel2013對試驗數據進行初步整理，采用SPSS20.0分析軟件進行單因素方差統計分析，數據用平均值±標準差表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，以P<0.01作為差異極顯著判斷標準。

2 結果與分析

2.1 女貞子多糖對感染大腸桿菌仔豬血清抗氧化指標的影響 由表2可知，試驗Ⅰ組仔豬血清MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)，而超氧化物歧化酶(SOD)含量顯著低于對照組(P<0.05)。試驗Ⅰ組仔豬血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量與試驗Ⅲ組無顯著差異(P>0.05)，且試驗Ⅱ與試驗Ⅰ組亦無顯著差異(P>0.05)。對照組仔豬血清過氧化氫酶(CAT)含量顯著高于其余各組(P<0.05)，且其余各組間無顯著差異(P<0.05)。

2.2 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬肝、腎抗氧化指標的影響 由表3可知，肝臟MDA含量大腸桿菌組最高，和其它三組比較差異極顯著(P<0.01)，SOD含量大腸桿菌組最低，比對照降低了57.86%，差異極顯著(P<0.01)；腎臟MDA含量各組差異不顯著(P>0.05)，SOD含量大腸桿菌組比對照組下降了58.21%，差異極顯著(P<0.01)。

2.3 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬肝臟氧化應激相關基因表達的影響 由表4可知，肝臟CAT基因轉錄水平：大腸桿菌組顯著高于對照組和大腸桿菌+女貞子多糖組(P<0.05)，與女貞子多糖組差異不顯著(P>0.05)；錳超氧化物歧化酶(MnSOD)和鋅銅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)各組變化趨勢基本一致；谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)：大腸桿菌組顯著高于其它各組(P<0.05)；谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)各組差異不顯著(P>0.05)。

表2 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響Tab 2 Effects of ligustrum polysaccharide on serum antioxidant indexes of weaned piglets

同行數據相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

表3 女貞子多糖對斷奶仔豬感染大腸桿菌肝腎抗氧化能力的影響Tab 3 Effects of ligustrum polysaccharide on liver and kidney antioxidant capacity of weaned piglets infected with E.coli

同行數據相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

表4 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬肝臟的氧化應激相關基因mRNA表達的影響Tab 4 Effects of ligustrum polysaccharide on mRNA expression of oxidative stress related genes in liver of weaned piglets infected with E.coli

同行數據相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

2.4 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬炎癥介質與細胞內分子相關基因表達的影響 由表5可知，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)各組均高于對照組且差異極顯著(P<0.01)；熱休克蛋白70(HSP70)各組均高于對照組且差異極顯著(P<0.01)；環氧酶2(COX2)各組差異不顯著(P>0.05)。

表5 女貞子多糖對斷奶仔豬感染大腸桿菌炎癥介質與細胞內分子相關基因表達的影響Tab 5 Effects of ligustrum polysaccharide on the expression of intracellular molecule-related genes and inflammatory mediators of weaned piglets infected with E.coli

同行數據相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

表6 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬肝組織MAPK相關基因表達的影響Tab 6 Effects of ligustrum polysaccharide on MAPK-related gene expression in liver of weaned piglets infected with E.coli

同行數據相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

3 討論與結論

3.1 女貞子多糖對大腸桿菌誘導斷奶仔豬氧化應激的保護作用 大腸桿菌可以引起斷奶仔豬應激，產生大量自由基，進而導致仔豬機體的氧化損傷[6]。通過一系列的脂質過氧化反應最終產生MDA，其含量的高低能夠間接反應自由基產生的多少，也可以體現脂質過氧化在畜禽機體組織細胞內的反應程度。SOD和GSH廣泛的存在動物機體的組織中，可以使超氧陰離子O2-轉化為H2O2進而被清除，它含量的高低能夠反映出動物機體清除自由基的能力[7]。動物機體內的CAT是防御體系非常重要的酶，能夠將過氧化氫(H2O2)轉化為分子氧和水。

前期研究發現，女貞子萃取物可以有效降低仔豬血清和肌肉中的MDA含量，提高肝臟SOD和血清GSH-Px水平。植物多糖可以顯著提高斷奶仔豬血清總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性和總抗氧化能力，降低血清和組織中的MDA含量[8]。研究發現，女貞子多糖可以顯著降低由大腸桿菌引起的仔豬血清MDA含量的升高，對大腸桿菌引起的抗氧化酶下調有緩解作用，但對正常對照組仔豬無顯著影響，揭示出女貞子多糖對仔豬的調節保護作用。本課題組前期研究表明仔豬人工感染大腸桿菌后，血清生化指標顯示肝、腎功能異常，研究選取肝、腎組織兩個關鍵氧化指標MDA和SOD作為參數[7]。從結果來看女貞子多糖可以通過調節肝腎組織中MDA和SOD的水平，起到保護肝腎的目的，這與前期的研究相一致。

3.2 女貞子多糖對大腸桿菌仔豬肝臟氧化應激相關轉錄因子和MAPK信號的調控 GPX1、GPX4是GSH-Px家族的同工酶，它能夠使細胞避免氧化攻擊、抵抗脂質過氧化反應和清除動物機體內的氧自由基。GPX4在機體內對磷脂氫過氧化物有比較高的活性，與VE結合能夠起到抗氧化的作用，并且能夠還原磷脂，使動物機體的細胞避免脂質過氧化。

研究發現，斷奶仔豬感染大腸桿菌后，肝臟GPX1基因轉錄水平有所升高，預示肝組織將產生更多的GSH-Px酶抵御氧化應激。

CuZnSOD能夠將超氧陰離子的自由基轉移性清除，在維持動物機體內的氧自由基相對平衡能夠起到十分重要的作用。在動物發生氧化應激的時候MnSOD有著非常迅速的反應性，以及它在細胞的線粒體中能夠將超氧化物轉化為氧分子和H2O2，進而把機體內有害的ROS清除。與CAT相關的基因能夠調節機體內過氧化氫酶的分泌與合成，CAT在機體內能夠將H2O2轉化成水和分子氧，進而使H2O2得到清除，使機體免受過氧化的傷害。研究發現，當仔豬感染大腸桿菌后，女貞子多糖可以提高仔豬肝臟中CAT和CuZnSOD轉錄水平，從而清除體內過量的氧自由基。

COX2和TNF-α是動物體內非常重要的急性炎癥因子，正常情況下表達量很少或者不表達，機體在發生炎癥后，COX2和TNF-α的表達量會大幅增加。HSP在細胞內能夠起到保護作用，在動物機體細胞當中能夠找到高效的HSP70，它能夠緩解機體發生的炎癥反應，并且對肝臟的再生起到促進作用。有研究證實，動物機體細胞內的HSP70能夠與NF-κB相互反應，避免NF-κB在動物機體內活化[9]。實驗表明仔豬感染大腸桿菌后，肝臟COX2基因表達量相對不變，而TNF-α的表達量極顯著升高；女貞子多糖前處理后，TNF-α的表達量變化不顯著，但攻毒大腸桿菌后TNF-α的表達量極顯著降低。這說明在正常情況下，女貞子多糖對仔豬肝臟TNF-α的轉錄表達無影響，但可以降低大腸桿菌攻毒后的轉錄表達，提示女貞子多糖對肝組織的保護機理與抑制急性炎癥因子相關。

MAPK是一種絲氨酸蛋白激酶或者是一種蘇氨酸蛋白激酶，能夠感受上游受體傳來的信號，并且能夠將信號傳導到相應的細胞核當中，能夠調節基因的表達以及細胞的增殖和凋亡。MAPK由三種重要的蛋白激酶組成,ERK對細胞能夠起到保護的作用，而P38和JNK對細胞起到促進凋亡的作用[10]。MAPK信號通路當中Ras/Raf/MEK/ERK信號通路是一條比較成熟的通路，它能夠將細胞膜的受體所接受信號轉移到細胞核內，進而細胞內相應蛋白得到了表達，它可以調節細胞的自噬、凋亡、分化和增殖等重要功能[11-12]。研究表明抑制ERK信號通路之后，可以緩解氧化損傷對細胞的損害，與之相反，激活ERK信號通路能夠對細胞起到損傷的作用。本試驗通過研究發現仔豬肝臟mRNA轉錄水平ERK1的大腸桿菌+女貞子多糖組與大腸桿菌組相比降低且差異極顯著，而女貞子多糖組與對照組相比差異不顯著，說明女貞子多糖對斷奶仔豬感染大腸桿菌起到了保護作用，且對正常仔豬沒有不良影響，但P38和JNK基因表達相對較低，與上述研究一致。

3.3 結論 女貞子多糖可以通過調節肝臟抗氧化指標保護大腸桿菌引起的仔豬氧化應激反應，其作用機制可能與下調MAPK相關信號轉錄水平有關，從而揭示女貞子保護仔豬肝臟的分子機理。