9號染色體倒位攜帶對于胚胎染色體及妊娠結局的影響

陳歡，沈鑒東，謝佳孜，孫雪萍，崔毓桂，劉嘉茵，吳畏

(南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學科，南京 210029)

染色體結構異常的基礎是染色體發生斷裂及斷裂后的異常重接。臨床上較常見的染色體結構異常主要有：易位(相互易位，羅伯遜易位)、倒位、片段缺失(末端缺失、中間缺失)、片段插入、環狀染色體、雙著絲粒染色體、等臂染色體等。染色體倒位又細分為臂間倒位和臂內倒位。臂內倒位(paracentric inversion)某一染色體臂內發生二次斷裂后，所形成的中間片段旋轉180°重接，即形成臂內倒位。臂間倒位(pericentric inversion)一條染色的長臂和短臂各發生一次斷裂后，形成的臂間倒位重接。世界上已報告的臂內倒位已有23種，臂間倒位24種[1]。其中，9號染色體的臂間倒位[inv(9)]較為多見，在人群中發生率為1%～3%，在亞洲人群中發生率最低約0.25%[2-4]。從遺傳物質的得失角度看，這種結構變化沒有導致遺傳物質的丟失，因此具有倒位染色體的個體一般不具有臨床表型，被稱為攜帶者，被認為是與異常表型無關的染色體微小重排[4-6]。inv(9)一般被認為是染色體多態性，但研究發現inv(9)與不育、復發性流產等不良妊娠結局可能相關[2，7-17]或可能存在特發性生殖障礙[18]，inv(9)對妊娠結局的影響仍存在爭議。復發性自然流產(RSA)是指與同一性伴侶連續遭受2次或2次以上在妊娠20周前的胎兒(體重≤500 g)丟失者，病因復雜，包括遺傳因素、解剖異常、內分泌異常、感染因素、免疫紊亂和血栓前狀態等，仍有接近半數的患者原因不明，臨床上稱為原因不明復發性流產(URSA)。已知的因素中50%～60%的早期自然流產是由于胚胎染色體異常所致[19-21]。因此，RSA是胚胎植入前遺傳學篩查(Preimplantation genetic test for aneuploidies，PGT-A)的指征。對于inv(9)特別是合并流產史患者，是否需要行PGT-A仍然是困惑的問題[22]。本研究通過分析攜帶inv(9)的不孕癥患者PGT-A胚胎檢測及妊娠結局，為攜帶inv(9)的不孕癥患者是否需要行(PGT-A)以及何種類型需要行PGT-A提供依據。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2007年9月至2018年6月在本中心接受PGT-A治療的165對RSA夫婦的診療過程及妊娠結局。其中一方攜帶inv(9)的30對夫婦為A組；未攜帶inv(9)的135對夫婦為B組。所有這些患者均采用中心常規的PGT-A治療流程。

二、研究方法

1.控制性促排卵：所有患者采用合適的方案促排卵。當主導卵泡直徑達到18 mm左右給予HCG注射，36 h后行陰道超聲介導下取卵術。根據患者情況選擇新鮮周期或復蘇周期移植。

2.受精、卵裂、胚胎移植情況：取卵術后第1日觀察卵子受精情況，雙原核(2PN)卵子作為正常受精卵。觀察至D3或D5、D6行卵裂期胚胎(卵裂球活檢)或囊胚期胚胎(滋養細胞活檢)活檢取樣。

3.胚胎檢測：使用熒光原位雜交(FISH)、微陣列-比較基因組雜交(aCGH)或二代測序技術(NGS)。選擇檢測為正常/平衡信號的胚胎移植。

4.妊娠結局隨訪：移植后2周測血清β-HCG；HCG陽性者停經50 d左右行陰道超聲檢查，觀察宮腔內孕囊數目和胎心管搏動以確定臨床妊娠，統計胚胎種植率和臨床妊娠率等；停經70天再次超聲檢查確定胚胎發育情況；后期電話隨訪本周期妊娠結局，統計流產率和胎兒畸形率、性別、出生體重、妊娠孕周及有無先天畸形等情況。

三、統計學方法

結 果

一、患者基本情況比較

共納入165例患者。其中inv(9)攜帶組(A組)30例，非inv(9)攜帶組(B組)135例。A組未移植與無可移植胚胎均為2例，B組未移植6例、無可移植胚胎25例。兩組患者中無可移植胚胎者原因為卵母細胞質量差、未形成囊胚或胚胎檢測染色體異常。

A組與B組間女方體重指數(BMI)、基礎FSH、AMH水平相比較差異均無統計學意義(P>0.05)；B組患者的既往流產次數及女方平均年齡顯著高于A組(P<0.05)(表1)。B組患者既往流產次數多于A組可能與其女方年齡大相關。

二、患者促排卵治療實驗室指標比較

兩組間獲卵數、受精率以及獲胚數無統計學差異(P>0.05)；B組獲卵數、平均移植胚胎數顯著低于A組，而胚胎種植率顯著高于A組(P<0.05)(表2)。A組患者獲卵數高于B組可能與B組患者年齡偏大有關。

表1 患者的基本情況(±s)

注：與A組比較，*P<0.05

表2 患者的促排卵治療實驗室指標[(±s)，%]

注：與A組比較，*P<0.05

三、患者妊娠結局比較

一次取卵周期中，A組移植人數為26人，總移植周期為34周期，每移植周期臨床妊娠率為58.8%，活產率為44.1%，每取卵周期累積妊娠率為76.9%，流產率為25.0%；B組移植人數為104人，總移植周期為125周期，每移植周期臨床妊娠率為61.6%，活產率為51.2%，每取卵累積妊娠率為74.0%，流產率為16.9%。A組與B組的妊娠率、活產率及流產率的差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。

四、胚胎檢測結果比較

A組檢測胚胎數209枚，結果異常胚胎130枚，胚胎染色體異常率為62.2%。其中通過NGS或array CGH進行胚胎檢測有75枚，染色體異常率為46.6%，但異常染色體均非9號染色體。

B組活檢胚胎數532枚，胚胎染色體異常率51.5%。

A組胚胎檢測染色體異常率顯著高于B組(P<0.05)(表4)。統計A、B組胚胎檢測結果，≥3條染色體異常較多見，A組有4枚而B組有63枚，多倍體異常A組有1枚而B組有2枚，單一胚胎染色體異常分布情況見圖1。A組1、2、7、13、15、16、18、21染色體異常率較高，但整體來看染色體異常分布無明顯集中，而B組8、15、16、21、22號染色體異常概率較高。

表3 患者一次取卵周期妊娠結局(%)

注：累計妊娠率為累計至2018年6月一次取卵周期累計妊娠數/移植夫婦數

表4 患者胚胎檢測結果統計(%)

注：嵌合體胚胎屬于胚胎檢測異常；與A組比較，*P<0.05

圖1 兩組胚胎檢測結果分布統計

討 論

關于inv(9)是否影響生育一直未有定論，部分學者認為從遺傳學的角度看，某種變異的人群發生率>1%，即為正常多態性，9號染色體臂間倒位在各版的ISCN中都被列為染色體的正常多態性改變，其攜帶者由于遺傳物質未有明顯增減，故可能沒有表型效應。但有一些學者認為inv(9)與其他倒位一樣，雖然沒有遺傳物質丟失，但由于基因的排列順序發生變化，倒位理論上可形成倒位圈，可能引起位置效應，從而影響配子、胚胎全染色體組拷貝數變化，從而引起流產、不孕不育等臨床表現[2，7，13-15，23]。這些學者提出兩種機制，一種認為倒位本身可能在減數分裂過程中妨礙配對的同源染色體；第二種機制就是染色體間存在的相互效應，認為inv(9)可以影響其他染色體配對，因為9號同源染色部分單體未配對而干擾其他的二價染色體配對分離[24-26]。

本研究中inv(9)攜帶者的胚胎檢測結果中并未見與inv(9)相關的染色體變異，可能會有專家認為這一點本身就足以說明9號染色體臂間倒位與不良妊娠結局沒有關聯，但是考慮胚胎染色體異常率較單純RSA患者高且具有統計學意義(所有病例已經針對復發性流產檢查了目前可做的檢查，未見異常或者有相關異常已做處理復查未見異常)。胚胎染色體異常一般與母親年齡相關，而B組女方平均年齡大于A組。綜上我們可以認為inv(9)可能通過干擾其他染色體二價體形成分離導致胚胎染色體異常率增加趨勢，從而引起流產、胎兒畸形等臨床表現。關于這種染色體間相互作用目前有兩種假說，一是認為與兩條9號染色體間異染色質長度差異相關，且有實驗研究證明倒位至少需涉及染色體總長的30%才能產生重組染色體[25，27]，當涉及染色體總長的50%以上時，重組染色體風險明顯增加，重組配子的頻率與倒置染色體的比例直接相關[28-29]。另一種則認為與斷裂位點的位置相關，認為若有一個斷裂點位于G顯帶暗區，由于缺少同源性會發生異型聯會[30]，或認為染色體有重組熱點簇的存在，重組體的形成取決于特定區域中熱點的存在和數量以及重組頻率[31]。此外有的關于唐氏綜合征家族的研究揭示了父母任一方inv(9)與子代唐氏綜合征發生率的增加直接相關。分析倒位增加了染色體不分離的風險，與染色體間相互作用的假說相一致。有研究認為異染色質特別是9號染色體，在減數分裂期間影響近端著絲粒染色體(13、14、15、21、22、Y)分離[14，27，32-34]。但依據我們的研究inv(9)攜帶者胚胎染色體異常率較高，但其無明顯分布特點，并未觀察到端著絲粒染色體異常檢出率增加。inv(9)的這種染色體間相互作用的機制尚不明確，需要分子水平上進行更多的研究，以了解染色體斷裂點的重要性。且本研究樣本數少，有待于擴大樣本量進一步深入研究。但由于這種染色體間相互效應，推薦inv(9)攜帶且有多次流產史者可考慮PGT-A。

染色體臂內倒位攜帶者，減數分裂過程通過倒位圈產生4種類型配子，1種正常，其中1種倒位攜帶，其余2種含有部分重復和缺失的無著絲粒片段或雙著絲粒染色體，使得半數配子的形成出現障礙，或出現半數畸形或無功能的配子，致使婚后多年不孕；同時，雙著絲粒染色體和無著絲粒片段在有絲分裂中為不穩定性畸變，雙著絲粒在合體的早期分裂中形成染色體橋，即使能懷孕，其后代在很早期即死亡[35]。納入樣本中僅有1例臂內倒位行PGT-A助孕，其胚胎檢測染色體異常率高，但本研究中臂內倒位樣本量太少，有待于擴大樣本量進一步深入研究。

綜上所述，inv(9)可能有增加其他染色體異常率的趨勢，導致流產風險增加。對于inv(9)攜帶同時伴有多次流產史、不良孕產史者可考慮PGT-A助孕；而無反復流產史或不良孕史等，僅inv(9)攜帶的不孕患者，常規IVF/ICSI助孕即可。