褪黑素保護(hù)卵母細(xì)胞應(yīng)對熱應(yīng)激損傷的研究

杜海燕，王守紅，黃薇薇

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，包頭 014010)

哺乳動物具有在35～39℃的范圍內(nèi)保持生理功能的能力，恒定的體溫對于生物體的正常生理功能十分重要。在持續(xù)高溫的情況下，動物的身體會對惡劣的環(huán)境做出一系列的生理和病理變化，如果溫度過高，身體的調(diào)節(jié)能力就會受到限制。當(dāng)溫度高達(dá)41℃時，大多數(shù)動物都不能忍受這種壓力，生理功能會受到損害[1]。哺乳動物的生殖系統(tǒng)比其他身體部位對溫度更加敏感。大量研究表明，熱激刺激(heat stress，HS)對哺乳動物精子的生成、卵母細(xì)胞的成熟、早期胚胎的發(fā)育以及胎兒的生長發(fā)育有著嚴(yán)重影響。HS可以通過多種途徑導(dǎo)致卵母細(xì)胞的成熟障礙，可能影響顆粒細(xì)胞中類固醇激素(如LH)的合成[2]；HS能夠損傷體外成熟卵母細(xì)胞的染色體和細(xì)胞骨架，從而降低胚胎發(fā)育率[3]。另有研究表明，HS促使豬顆粒細(xì)胞凋亡，加速卵泡閉鎖，最終顯著降低排卵率[4]。隨著對凋亡相關(guān)基因caspase的抑制，HS對牛胚胎發(fā)育潛能的不良影響顯著降低[5]。在小鼠卵母細(xì)胞中，HS促使活性氧簇(ROS)水平過量表達(dá)，降低谷胱甘肽的含量，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生[6]。而氧化應(yīng)激是危害細(xì)胞正常生理功能的最常見因素之一，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。抗氧化劑可以改善細(xì)胞的生存環(huán)境，減少HS對細(xì)胞的損傷。褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)是最有效的氧化劑之一。褪黑素在卵母細(xì)胞成熟、排卵和早期胚胎發(fā)育等方面，起到重要的作用。研究結(jié)果顯示，褪黑素可以改善牛卵母細(xì)胞的質(zhì)量，從而提高胚胎的發(fā)育率[7]，或許可以成為治療不孕癥的一種新的輔助藥物[8]。盡管許多研究已經(jīng)報道了褪黑素對卵母細(xì)胞的體外成熟有促進(jìn)作用，但是具體機制尚不清楚。本研究通過建立卵母細(xì)胞的HS模型，確定HS與卵母細(xì)胞成熟受損之間的潛在關(guān)系，再通過體外添加褪黑素，探討在HS下褪黑素促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的作用機制。

材料與方法

一、實驗動物

8周齡ICR小鼠購于內(nèi)蒙古大學(xué)SPF級實驗動物繁育室，飼養(yǎng)溫度22～24℃，濕度40%～60%，12 h光照/12 h黑暗交替，喂養(yǎng)滅菌營養(yǎng)顆粒飼料，自由采食飲水。本研究所涉及的動物實驗均遵照內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)《實驗動物管理與使用操作規(guī)范》執(zhí)行。

二、研究方法

1.卵母細(xì)胞的收集和體外成熟：使用成年8周齡ICR雌性小鼠，皮下注射10 U 孕馬血清促性腺激素(PMSG)，48 h后頸椎脫臼處死小鼠，取出卵巢扎破卵巢，取出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，使用口徑合適的玻璃針反復(fù)吹吸去除卵丘細(xì)胞，置于CZB培養(yǎng)液(Sigma，美國)中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.5 h統(tǒng)計生發(fā)泡破裂(GVBD)比率，GVBD率=(發(fā)生GVBD的卵母細(xì)胞/全部卵母細(xì)胞)×100%；14 h統(tǒng)計第一極體排放(PBE)比率，PBE率=(排出第一極體的卵母細(xì)胞/全部卵母細(xì)胞)×100%。

2.熱激處理及藥物處理：將卵母細(xì)胞隨機分成3組，分別是對照組(Ctrl組)、熱激組(HS組)和熱激+褪黑素組(HS+M組)。褪黑素(Sigma，美國)濃度為1×10-9mol/L[9]。培養(yǎng)滴平衡過夜，對照組卵母細(xì)胞置入含2.5 μmol/L米力農(nóng)(milrinone，Sigma，美國)的CZB培養(yǎng)液中使卵母細(xì)胞處于GV期，37℃、5%CO2培養(yǎng)10 h；將HS組卵母細(xì)胞和HS+M組卵母細(xì)胞置于含2.5 μmol/L米力農(nóng)的CZB培養(yǎng)液中42℃、5%CO2培養(yǎng)箱熱應(yīng)激10 h。隨后將3組卵母細(xì)胞同時在微滴中洗掉米力農(nóng)轉(zhuǎn)入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)。

3.紡錘體及染色體熒光染色：收集卵母細(xì)胞后，置于臺氏液中去除透明帶，4%PFA室溫固定30 min，0.5% Triton X-100中室溫通透1 h，1% BSA室溫封閉1 h；一抗anti-β-tubulin(Abcam，美國)1∶2 000，4℃孵育過夜；二抗FITC-Donkey Anti-Rabbit IgG(Jackson ImmunoRearch，美國)1∶1 000室溫避光孵育1 h，PI(Sigma，美國)1∶50復(fù)染，室溫10 min，封片共聚焦顯微鏡觀察，成像。

4.卵母細(xì)胞早期凋亡測定：細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所，按照操作說明書進(jìn)行檢測。Binding buffer 和Annexin-V-FITC比例為10∶1，避光孵育10 min后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察、統(tǒng)計并拍照，卵母細(xì)胞早期凋亡即卵母細(xì)胞膜上存在綠色熒光信號，凋亡率=(存在熒光信號的卵母細(xì)胞/全部卵母細(xì)胞)×100%。

5.蛋白印跡法檢測熱休克蛋白70：將收集的卵母細(xì)胞加入13 μl裂解液(Bio-rad，美國)后的蛋白樣品煮沸5 min，上樣于12%的分離膠，電泳恒電壓120V，150 min。運用濕轉(zhuǎn)裝置，恒電流200 mA，轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉封閉2 h。選取目的蛋白的條帶位置，分別孵育一抗Anti-Hsp70(Abcam，美國)、Anti-β-tubulin(Abcam，美國)1∶500，4℃過夜孵育。二抗Perox-AffiniPure Dnk Anti-Rabbit IgG(Jackson ImmunoRearch，美國)1∶2 000，37℃，1 h。孵育HRP化學(xué)發(fā)光底物(Pierce，美國)ECL檢測，成像。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、褪黑素促進(jìn)熱激后卵母細(xì)胞的成熟

通過對卵母細(xì)胞進(jìn)行熱激處理，并在熱激后添加褪黑素體外培養(yǎng)14 h后進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果表明，與對照組相比，HS組卵母細(xì)胞GVBD率與PBE率顯著降低(P<0.01)；當(dāng)在熱激后的卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加褪黑素后，與熱激組相比，GVBD率(P<0.05)與PBE率(P<0.01)均顯著提高，但是仍顯著低于對照組(P<0.01)(表1、圖1)。

表1 褪黑素對熱激后卵母細(xì)胞成熟的影響(±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與HS組比較，#P<0.05，?P<0.01

標(biāo)尺=100 μm圖1 不同處理組卵母細(xì)胞成熟狀況

二、褪黑素改善熱激后卵母細(xì)胞的紡錘體異常

為了研究褪黑素是如何改善卵母細(xì)胞的質(zhì)量，我們通過免疫熒光染色觀察了紡錘體微管情況，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，熱激后的卵母細(xì)胞發(fā)生了紡錘體的組裝異常，從而導(dǎo)致無法使染色體正確排列到赤道板(圖2)。通過統(tǒng)計異常的紡錘體的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，HS組異常紡錘體的比率有顯著提高(P<0.01)；當(dāng)添加褪黑素后，一定程度的改善了紡錘體裝配異常，與HS組相比差異顯著(P<0.01)，但是并沒有恢復(fù)到對照組水平(P<0.01)(表2)。

三、褪黑素減少熱激后卵母細(xì)胞早期凋亡

卵母細(xì)胞的早期凋亡情況結(jié)果表明，通過熱激處理的卵母細(xì)胞與對照組相比，顯著提高了細(xì)胞的凋亡率(P<0.01)；在添加褪黑素后，能夠在一定程度上降低HS所致細(xì)胞凋亡(P<0.01)(表3、圖3)。

紅色：染色體；綠色：紡錘體；標(biāo)尺=20 μm圖2 不同處理組MII卵母細(xì)胞紡錘體狀況(染色體復(fù)合體免疫熒光染色)

表2 褪黑素對熱激后卵母細(xì)胞紡錘體異常率的影響(±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與HS組比較，#P<0.01

表3 褪黑素對熱激后卵母細(xì)胞早期凋亡的影響(±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與HS組比較，#P<0.01

早期凋亡的信號為卵母細(xì)胞膜上的綠色熒光圖3 不同處理組MII卵母細(xì)胞的早期凋亡狀況

四、褪黑素通過HSP70的過表達(dá)改善卵母細(xì)胞質(zhì)量

為了研究褪黑素是通過何種機制來改善卵母細(xì)胞，我們檢測了卵母細(xì)胞中熱休克蛋白70(HSP70)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，熱激后導(dǎo)致HSP70蛋白表達(dá)量有所上調(diào)，但與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；添加褪黑素導(dǎo)致HSP70蛋白表達(dá)量與對照組和HS組相比顯著提高(P<0.01)(圖4)。

與其他兩組比較，*P<0.01圖4 不同處理組卵母細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)情況

討 論

熱激會導(dǎo)致動物生殖系統(tǒng)的氧化損傷，引起細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。例如，高溫能顯著誘導(dǎo)豬卵巢濾泡和顆粒細(xì)胞凋亡[10]。人工授精22 h后暴露于42℃持續(xù)9 h，造成豬胚胎發(fā)育異常[11]。本研究結(jié)果表明，HS能顯著的影響卵母細(xì)胞的GVBD率和第一極體排放率，這與前人的研究結(jié)果一致，HS影響卵母細(xì)胞的成熟，進(jìn)而影響胚胎的發(fā)育潛能[12]。通過免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)HS能夠影響在卵母細(xì)胞成熟過程中微管的組裝，從而使卵母細(xì)胞無法正常排出第一極體。本研究還檢測了卵母細(xì)胞的早期凋亡，發(fā)現(xiàn)HS會顯著增加卵母細(xì)胞早期凋亡的比率，通過添加褪黑素有效地降低了早期凋亡的比率，但是沒有恢復(fù)到對照組水平。

褪黑素是一種有效的抗氧化劑，褪黑素及代謝產(chǎn)物N1-乙酰基-N2-甲氧基尿胺和N1-乙酰基-5-甲氧基尿胺可以直接清除活性氧，刺激抗氧化酶的產(chǎn)生。此外，褪黑素可以通過螯合過渡金屬從而減少羥基自由基的形成，因此，褪黑素可能通過這種機制改善了熱應(yīng)急帶來的卵母細(xì)胞的成熟障礙。除此以外，有研究表明，HSP70是一種維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定環(huán)境和抑制細(xì)胞凋亡的多因素作用因子[13]。HSP70通過調(diào)節(jié)caspase-3和細(xì)胞色素C，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的影響，并在凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的下游發(fā)揮作用。高水平的HSP70通過上調(diào)SPKH1、BCL-2、SOD1、CAT和CPX4而下調(diào)p53，從而幫助卵母細(xì)胞存活[14-16]。因此，通過我們的檢測結(jié)果表明，褪黑素能夠改善卵母細(xì)胞的質(zhì)量，可能是通過HSP70的表達(dá)上調(diào)來保護(hù)卵母細(xì)胞。

總之，在體外培養(yǎng)條件下，HS會影響卵母細(xì)胞的成熟。這可能是由于氧化應(yīng)激和干擾激素產(chǎn)生引起的，反過來，這又導(dǎo)致了核成熟和細(xì)胞周期的停滯。此外，HS可能通過抑制線粒體的正常功能，導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟障礙，甚至發(fā)生早期凋亡。褪黑素可通過消除ROS和調(diào)節(jié)類固醇激素的產(chǎn)生而顯著促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟[17]。更重要的是，褪黑激素保護(hù)線粒體免受應(yīng)激損傷帶來的早期凋亡[18]。此外，卵母細(xì)胞可能有一種自我防御機制來提高內(nèi)源性褪黑激素的產(chǎn)生來改變HSP70的表達(dá)。所有這些機制都有助于卵母細(xì)胞對抗HS。