宮腔粘連患者月經血中與ECM降解相關因子的表達及意義

章曉樂，遲令侃，張瓊，王萍，齊聰*

(上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 1.婦科；2.輔助生殖科，上海 201203)

子宮內膜損傷是宮腔手術或感染損傷子宮內膜基底層，導致上皮、間質細胞再生障礙，新生血管形成受損，子宮內膜難以完成自我修復，嚴重者往往造成宮腔粘連(IUAs)[1-2]。Salzani等[3]報道人工流產術后子宮內膜損傷發(fā)生率高達37.6%，而我國上海2014年的研究報道稱58.3%的IUAs患者有宮腔操作史[4]。中重度IUAs分解手術后再粘連率高達62.5%[4]。IUAs的發(fā)生與子宮內膜干細胞數量減少甚至缺失、纖維細胞合成大量的細胞外基質(ECM)有關。ECM中膠原蛋白如Ⅰ型膠原α1鏈(COLIA1)的異常累積，是IUAs形成的主要基礎[5]。ECM降解相關的因子有基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)。目前診斷子宮內膜損傷情況的金標準是宮腔鏡下子宮內膜病理活檢，檢測內膜組織中MMP-9、TIMP-1、COLIA1等指標表達，但內膜活檢具有創(chuàng)傷性，患者依從性差，無法在臨床上普及使用，而通過非侵入性方法收集月經血則簡單易行[6]。諸多研究已經證實，月經血中含有大量子宮內膜細胞[6-7]，故推測取月經血的離心沉淀物替代內膜組織行以上指標檢測具有可行性。本文通過前瞻性研究對IUAs患者月經血中COLIA1、MMP-9、TIMP-1表達水平的變化進行觀察，并嘗試探討其臨床意義。

一、資料與方法

1.研究對象及分組：選擇2017年3月至2018年6月在上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院婦產科就診、經宮腔鏡明確診斷的IUAs患者30例為IUAs組。IUAs的診斷參考2015年《宮腔粘連臨床診療中國專家共識》，粘連性質分為膜性粘連、纖維性粘連和肌性粘連；根據分級評分標準9～18分為中度粘連，19～28分為重度粘連。選擇同期無性生活、于我院體檢的志愿者女性30例作為對照組。兩組入組標準：(1)既往月經規(guī)律；(2)經陰道或腹部B超監(jiān)測：無IUAs以外的明顯器質性病變；(3)性激素檢測正常范圍；(4)育齡期婦女(23～35歲)，非高危人工流產患者；(5)近2個月未接受任何生殖激素類藥物。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均已簽署知情同意書。

2.標本采集：囑兩組女性月經第2天來院取材，有性生活者留取月經血3 ml(于后穹隆內5 ml針筒去針抽取)，無性生活者清洗外陰后，針筒去針抽取自然排出陰道、留置于彎盤內的不含血塊的經血3 ml，均放置于抗凝管內保存。加入適量溶血劑，顛倒混勻，4℃ 10 00 rpm離心5 min后，棄上清液，取沉淀組織。采用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測MMP-9、TIMP-1、COLIA1 mRNA的表達水平，按照Trizol試劑盒(購自美國賽默飛公司)說明書，提取兩組對象的總RNA，檢索GenBank數據庫目的序列，采用Primer 5.0引物設計與分析軟件設計引物(表1)，各標本取2 μg總RNA逆轉錄成cDNA，并于20 μl反應體系(cDNA2.0 μl，上下游引物各0.3 μl，2×SYBR Green 10 μl，去離子水補足至20 μl)中進行反轉錄反應。反應在美國ABI Quantstudio5熒光定量PCR儀上進行，結果以MMP-9/β-actin、TIMP-1/β-actin、COLIA1/β-actin值表示。

表1 qRT-PCR引物序列、退火溫度及產物長度

二、結果

1.兩組對象基本資料比較：IUAs組患者中中度粘連16例，重度粘連14例；患者年齡24～33歲，平均(28.72±4.77)歲，平均體重指數(BMI)(21.94±2.45)kg/m2，月經周期平均(30.17±3.68)d。對照組年齡23～32歲，平均(27.57±4.15)歲，平均BMI(21.67±2.67)kg/m2，平均月經周期(29.93±2.47)d。兩組年齡、BMI、月經周期比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性(表2)。

2.兩組對象月經血中MMP-9、TIMP-1、COLIA1 mRNA表達水平比較：使用qRT-PCR檢測MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表達水平發(fā)現，IUAs組的MMP-9相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)；TIMP-1的相對表達量兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)；IUAs組MMP-9/TIMP-1的相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)(表3)。

表2 兩組對象基本資料比較(±s)

表3 兩組對象月經血中MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表達水平比較(±s)

注：與正常組比較，*P<0.05

3.月經血中MMP-9/TIMP-1、COLIA1表達與IUAs粘連特征的關系：在中度及重度IUAs患者月經血中，MMP-9/TIMP-1的相對量分別為(4.59±1.93)、(2.34±1.89)，二者比較有顯著性差異(P=0.024)。在膜性、纖維性及肌性粘連中MMP-9/TIMP-1的相對表達量分別為(5.11±1.76)、(3.01±1.57)、(2.27±1.39)，組間比較有顯著性差異(P=0.046)；纖維性粘連與肌性粘連組間比較無顯著性差異(P>0.05)。膜性、纖維性及肌性粘連中COLIA1的相對表達量分別為(3.44±1.72)、(4.32±1.73)、(6.25±1.34)，組間比較有顯著性差異(P=0.041)；膜性粘連與纖維性粘連組間比較無顯著性差異(P>0.05)(表4)。提示MMP-9/TIMP-1、COLIA1的表達可能與IUAs的嚴重程度及粘連性質有關。

表4 不同程度、性質粘連患者月經血中MMP-9/TIMP-1、COLIA1表達水平比較(±s)

注：與重度粘連比較，*P<0.05；與纖維性、肌性粘連比較，aP<0.05；與膜性、纖維性粘連比較，bP<0.05

三、討論

月經期子宮內膜中的功能層從基底層崩解脫離，內膜與血液混合排出[8]。經血包含月經血液，還含有部分子宮內膜[9]。育齡期女性在月經期子宮內膜調亡剝脫，但在隨后的月經周期中內膜能自我完成無疤痕修復。子宮內膜的再生能力暗示子宮內膜可能存在干細胞，其在內膜增殖的動態(tài)平衡和再生中起關鍵作用[10]。故月經血可以成為當今液體活檢標本的來源及子宮內膜干細胞庫。

本研究將月經血作為研究對象，研究發(fā)現，月經血離心沉淀的組織物中，COLIA1隨著IUAs程度加重表達增加。大量研究證實：子宮內膜受損后導致纖維化因子大量產生，刺激成纖維細胞合成大量的ECM，ECM合成和降解紊亂，導致ECM過度沉積，纖維粘連形成[5]，尤其是ECM中膠原的異常累積，含量迅速增加，成為纖維化的主要間質，是IUAs形成的主要基礎。同時在組織標本的研究中發(fā)現，IUAs嚴重的患者，ECM中COLIA1的異常累積也較多[11]。本研究同樣發(fā)現，較正常女性，IUAs患者月經血中COLIA1的表達增加，并隨IUAs程度的加重表達顯著。

眾多研究證實MMP-9、TIMP-1主要調節(jié)ECM成分的沉積和降解，并且廣泛分布于子宮內膜，與子宮內膜周期性增生和剝脫相一致，參與月經發(fā)生、內膜重塑、內膜血管修復等[12-13]。其中MMP-9屬于明膠酶，能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等，還可促進血管基底膜的降解。TIMPs是MMPs活性的天然抑制因子[14]。TIMP的過度表達抑制了MMPs的活性，使ECM降解減少，ECM的合成與降解失衡，致使ECM在子宮內膜組織中聚集，抑制正常子宮內膜組織生長，子宮內膜組織逐漸被纖維結締組織所取代，導致IUAs形成[15]。我們研究發(fā)現IUAs組月經血中的MMP-9顯著低于正常組，與成九梅等[16]、尚雪等[17]對子宮內膜標本的研究結果一致。MMPs/TIMPs的平衡是維持ECM內環(huán)境穩(wěn)定和完整的決定因素[18]。本研究發(fā)現IUAs組的MMP-9相對表達量和MMP-9/TIMP-1比值顯著低于正常組，并且MMP-9/TIMP-1比值隨著IUAs程度加重而減少。

綜上所述，我們發(fā)現IUAs患者月經血中存在與ECM降解相關因子的表達，提示臨床上或許可以選用月經血對IUAs程度進行無創(chuàng)評估。但因為研究納入樣本量較少，結果可能存在一定偏倚，后續(xù)需進一步擴大樣本量加以分析討論，以期為通過月經血判斷IUAs程度及IUAs治療效果評估等提供實驗依據。