200例稽留流產絨毛染色體的間期FISH分析

劉丹，丁翔，唐國棟，王燕春

(北京市海淀區婦幼保健院，北京 100080)

稽留流產是一種特殊但常見的自然流產，其發病率逐年增加。除了遺傳和子宮畸形等解剖學因素外，染色體異常是早期最常見和最重要的原因[1]。目前，臨床實踐中最常用的基因診斷技術是分析染色體G帶的核型分析技術、細菌人工染色體標記-磁珠分離法(BoBs)分子診斷技術和熒光標記的原位雜交技術(FISH)。近年，隨著染色體檢測技術的發展，間期FISH克服了對樣本要求較高、細胞培養周期長、失敗率高等缺點成為具有快速、準確、靈活特征的新型檢測方法。本研究中回顧性分析2016年1月至2018年9月在我院接受治療的稽留流產患者的絨毛組織進行了間期FISH檢測，并將結果報告如下。

一、資料與方法

1.研究對象：收集2016年1月至2018年9月在我院門診就診和病房住院的患者，納入標準：行B超檢查、血HCG和孕酮聯合檢測診斷為“稽留流產”、胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內未能及時自行排出需接受手術治療并要求檢測絨毛染色體的患者；身心健康，月經規律；血清檢查TORCH感染陰性；妊娠以來未使用過激素類藥物；無煙酒愛好、無接觸X射線和有毒物質的過去史；無子宮畸形。排除一些基礎性疾病史，如糖尿病、免疫系統疾病、精神疾病、遺傳性疾病等。共納入200例稽留流產患者。所有患者在進行相關檢查前均充分知情同意，并簽署相關知情同意書。

2．試劑和儀器：主要實驗試劑均購自北京博奧生物有限公司和北京益利精細化學品有限公司。相關試劑：緩沖貯存液：20×SSC，PH 5.3，用去離子水稀釋至500 ml，2～8°保存；緩沖液：2×SSC，PH(7.0±0.2)；變性液：70%(v/v)甲酰胺/2×SSC；乙醇溶液(70%乙醇、85%乙醇)；甲酰胺洗滌液：50%(v/v)甲酰胺/2×SSC；洗滌液：0.1%NP-40/2×SSC溶液，PH(7.0±0.2)；快洗洗滌液：0.3%NP-40/0.4×SSC溶液，PH 7.0～7.5；KCl低滲溶液(0.075 mol/L KCl)；固定液(甲醇∶冰乙酸體積比3∶1)；5 mg/ml DAPI復染劑母液(購自北京金菩嘉醫療科技有限公司)，0.2 μg/ml DAPI復染劑母液。

FISH探針：購自北京金菩嘉醫療科技有限公司。探針包括基因位點特異性探針和著絲粒特異性探針，分為3組：(1)GLP 13/GLP 21(DLEU2位點，標綠色；DSCR2位點，標紅色)；(2)GLP 16/GLP 22(CBFB位點，標紅色；BCR位點，標綠色)；(3)CSP 18/CSP X/CSP Y(18號染色體著絲粒，標天藍色；X染色體著絲粒，標綠色；Y染色體著絲粒，標紅色)。在42℃環境中，這些單鏈樣本和探針核酸根據堿基互補配對的原理特異性結合。正常細胞分別顯示2個DLEU2、DSCK2、CBFB、BCR基因座信號和2個18號、2個X或1個X、1個Y著絲粒信號。如果信號變化數目異常，則表明該標本染色體數目為非正常。

3.實驗方法及判斷標準：手術治療后取0.5 mg絨毛組織置于15 ml尖底離心管內，用剪刀剪碎，鹽水沖洗，離心去上清，60%的冰醋酸3～4 ml混勻，消化5 min，固定液固定，滴片，老化玻片，將該玻片于胃蛋白酶消化后漂洗5 min，依次置于預冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中進行梯度脫水3 min。將7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水和1 μl探針依次加至離心管中。離心1～3 s，混合渦旋后再次短暫離心。在(73±1)℃水浴鍋中持續變性5 min，置于45～50℃水浴，雜交前取出。為了避免氣泡，將該玻片置于預熱的濕盒內并在42℃培養箱內雜交過夜。甲酰胺洗滌玻片。

判斷標準：探針1：GLP 13/GLP 21正常信號類型：單元顯示2個綠色信號(DLEU2站點)和2個紅色信號(DSCR2站點)；異常信號類型：細胞顯示單個或者3個及3個以上綠色信號和/或紅色信號。探針2：GLP 16/GLP 22正常信號類型：細胞顯示兩個紅色信號(CBFB位點)和兩個綠色信號(BCR位點)；異常信號類型：細胞顯示單個或者3個及3個以上綠色信號和/或紅色信號。探針3：CSP 18/CSP X/CSP Y正常信號類型：細胞顯示兩個天藍色信號(染色體18上的中心體)，2個綠色信號(X染色體著絲粒位點)(雌性)或2個天藍色信號(中心體18個著絲粒)，1個綠色信號(X染色體著絲粒位點)，1個紅色信號(Y染色體著絲粒位點)(雄性)；異常信號類型：細胞顯示單個或者3個及3個以上天藍色信號，和/或出現非正常數目情況下的綠色和/或紅色信號。

隨機計數100個細胞，超過90%顯示正常類型提示為正常樣本；超過60%的細胞顯示異常信號類型，視為樣本異常。

二、結果

研究共納入200例患者，年齡22～47歲，孕周6～13周。200例絨毛組織樣本的間期FISH均獲得雜交信號，其中112例(56.00%)雜交結果異常標本中：常染色體單體2例，占1.79%(2/112)；常染色體三體型72例，占64.29%(72/112)；性染色體單體型19例，占16.96%(19/112)；性染色體三體型2例，占1.79%(2/112)；三倍體10例，占8.93%(10/112)；四倍體、嵌合體各1例，分別占0.89%(1/112)；其他5例，占4.46%(5/112)。具體間期FISH圖象和核型資料詳見圖1、表1。

三、討論

稽留流產目前是全球臨床妊娠最多見的并發癥之一，隨著人們生活節奏越來越快，工作壓力、精神壓力不斷增高以及環境的不斷惡化，該患病率逐年呈上升趨勢，不可避免地影響夫妻心身健康和家庭幸福感。尋找流產原因及指導下次妊娠成為當下亟待解決的問題及科研熱點。非整倍體是影響胚胎健康發育的主要因素[2]。染色體數目改變可導致胚胎發育異常、流產死產增加，即使正常分娩，個體發育容易出現性別發育障礙等問題。本研究中，200例稽留流產樣本中檢測到112例異常，檢出率為56.00%，與之前文獻[3]報道的50%以上相似，表明絨毛染色體的核型異常可能是導致胎停育的主要原因。但由于方法學限制，間期FISH只可檢測出染色體13、16、18、21、22、X和Y的數目異常，無法檢測染色體結構再次重排和變異的異常。本研究檢測到的異常類型中最常見的為常染色體三體。其中，16位和22位的三體最多，表明16和22三倍體可能是導致胚胎停育的高發類型，其次是21號三體。常染色體單倍型僅2例，因為單倍型具有低存活率，其少見于妊娠早期的生化妊娠。三倍體異常可以來自新的突變，或者配子在減數分裂過程中不分離，或者受精過程中分離異常[4]。這種異常類型通常在妊娠8周之前終止，并且關于純三倍體活嬰報道很少。其次是21例性染色體畸變，除2例性染色體三體外，其余19例均為特納(Turner)綜合征。45，X單體是人類唯一能生存的單體綜合征，患者第二性征發育不全且伴有原發性閉經[5]。其異常核型包括：(1)45，XO，是最多見的一型，95%的胚胎發生自然流產，只有少數幸存，且具有較為典型的特殊臨床表現；(2)45，XO/46，XX即嵌合型，約占Turner綜合征的25%；(3)46，Xdel(Xp)或46，Xdel(Xq)，即一條X染色體的短壁或長臂缺失；(4)46，Xi(Xq)：即一條X染色體的短臂已缺失，形成等臂染色體[6]。

圖1 112例異常染色體核型間期FISH檢測結果示例

染色體的數目及結構異常是稽留流產的主要原因之一[7]。由于FISH檢查本身的局限性，本研究未能對染色體結構異常進行檢測。自然流產是生物進化中異常生命體自然淘汰的過程，是人類生殖過程重要的優生選擇機制。此外，精神壓力，包括過度緊張、焦慮、恐懼、悲傷，甚至噪音影響[8]；流產次數[9]；遺傳基因缺陷：例如，夫婦的年齡、一方的染色體變異、夫妻的血型等[10]；不良生活習慣：如過度吸煙、酗酒、過量咖啡、海洛因等；環境因素，如空氣污染等[11]；母體本身疾病，如：生殖器官異常、HPV感染、CMV感染等；內分泌異常：嚴重的糖尿病未得到控制、黃體功能不足、甲狀腺功能降低、多囊卵巢綜合征；免疫功能異常等[12]均可能導致自然流產。Li等[13]通過使用qRT-PCR、免疫組化等方法發現腫瘤抑制基因程序性細胞死亡因子4(PDCD4)通過參與介導血清雌二醇和孕酮的表達水平以及相關細胞因子的表達，為治療稽留流產提供了新的診斷和治療策略。近年來對傷寒沙門氏菌等的探討對未來稽留流產的診療策略提供了廣泛的前景[14]。由于該種流產通常有相對較多的壞死組織、血凝塊和其他雜質，大多數絨毛細胞已經機化和變性，可以培養出細胞分裂象的幾率相對較小，染色體形態畸變不符合檢測要求，導致檢測失敗。而間期FISH檢測不需要細胞培養，因此不受組織污染的影響，具有樣本量小、操作簡便、檢測快速、成功率高的優點。可以為發病原因探討提供一定的理論依據，對于遺傳咨詢和指導下一次妊娠也具有積極意義[15]；但是，由于FISH只能檢測出7對染色體(13、16、18、21、22、X和Y)的數量，尚不能檢測染色體結構重排和變異，且該檢測方法對溫度、光照、濕度和各種試劑的PH值要求較高、費用相對昂貴，使其不能被大眾普遍認可，也成為該方法臨床應用的自身局限性。

表1 112例異常染色體類型和例數

綜上所述，染色體異常可能是稽留流產發生的主要因素之一；間期FISH的檢測方法對于稽留流產的病因診斷有一定的預測價值，但是是否值得臨床普及推廣還需要進一步探討驗證。