淫羊藿和甘草配伍對淫羊藿主要化學成分的影響

聶 靜，陳素娟，高 歌，楊芊芊，韓晶晶，王艷娟，李 強*

(1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488；2.吉林紫鑫藥業股份有限公司，吉林 130022)

淫羊霍為多年生草本植物淫羊霍的地上部分，作為滋補類中藥始載于《神農本草經》，已有2 000多年的歷史。淫羊藿味辛、甘，性溫，歸肝、腎二經，為補命門、益精氣、強筋骨、補腎壯陽之要藥[1]。淫羊藿的主要活性成分是以淫羊藿苷等為代表的異戊烯基取代黃酮苷類，但其水煎液提取率較低[2]。甘草為源自豆科的補益中草藥，能補脾益氣、清熱解毒、緩急止痛、調和諸藥[3]，在藥物配伍中發揮著重要作用。甘草皂苷是甘草的主要活性成分，其具有表面活性劑的性質，能在水溶液中形成膠束，具有增溶作用[4-6]。我國很多民間經驗方如補腎安神口服液和健陽片等均含有淫羊藿和甘草，但二藥配伍對淫羊藿苷等成分溶出量的影響目前研究較少。本文探討了淫羊藿和甘草以不同比例配伍煎煮時對淫羊藿所含淫羊藿苷等主要成分的影響[7-9]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀，包括四元泵、DAD檢測器、在線脫氣機、自動進樣器和柱溫箱(美國Waters公司)；Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，廣州艾欣科學儀器有限公司；98-1-B型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；BT25S型電子分析天平(上海荊和分析儀器有限公司)；0.45 μm 微孔濾膜(天津市津騰實驗設備有限公司)。

1.2試藥 淫羊藿苷對照品(中國食品藥品檢定研究院)；淫羊藿及甘草藥材(北京同仁堂藥店)，均符合《中國藥典》2015年版中藥用淫羊藿及甘草的規定[10]；乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；水為超純水。

2 方法與結果

2.1色譜條件 應用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 型色譜柱；水為流動相 A，乙腈為流動相B；流動相:乙腈-水(30∶70)；在流速1.0 mL·min-1下進行洗脫[11-14]；檢測波長：270 nm；柱溫：25 ℃。

2.2對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品3.78 mg，置于 25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3供試品溶液的制備 分別稱取淫羊藿和甘草飲片，按照1∶0，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，0∶1，1∶2，1∶3和1∶4的比例混合，每份均含淫羊藿10 g，置于燒瓶中，加10倍量純水浸泡 30 min 后，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濃縮并用水定容至100 mL量瓶中，分別得到11個樣品液。分別精密量取各樣品液 1 mL，置于11個10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用乙酸乙酯萃取3次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至5 mL，即得供試品溶液1～11[15]。

2.4淫羊藿苷的定性分析 分別取2.2項下制備的淫羊藿苷對照品溶液和2.3項下制備的供試品溶液1，注入液相色譜儀，測定并繪制其色譜圖，見圖1。由圖1可知，特征峰的保留時間一致(tR1=11.376 min，tR2=11.341 min)，且兩峰的形態相同，說明兩峰是同一物質。

圖1 HPLC圖

A.淫羊藿苷對照品溶液;B.供試品溶液1；1.淫羊藿苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.icariin reference substance；B.sample solution 1；1.icariin.

2.5方法學考察

2.5.1標準曲線的建立 精密吸取2.2項下制備的對照品溶液適量，加甲醇制成質量濃度分別為4.03，12.09，24.18，48.36，96.72和193.44 μg·mL-1的對照品溶液，各吸取10 μL，進樣，依法測定,以峰面積值(y)對進樣量(x)進行線性回歸，得回歸方程為y=3 777.6x+25.991(r=0.999 9)，線性范圍為0.040 3～1.934 4 μg。

2.5.2精密度實驗 取2.3項下制備的供試品溶液1，按照2.1項下色譜條件，連續進樣6次，每次5 μL，計算淫羊藿苷峰面積的RSD值為0.72%，結果表明，該儀器精密度良好。

2.5.3穩定性實驗 取2.3項下制備的供試品溶液1，分別于制備后0，1，2，4，8，12和24 h進樣分析，測定淫羊藿苷峰面積RSD值為1.27%，表明淫羊藿苷在24 h內穩定。

2.5.4加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的淫羊藿0.1 g，6份，加入2.2項下制備的淫羊藿苷對照品溶液，按照2.3項下供試品溶液制備方法進行制備，按照2.1項下色譜條件進樣測定，結果淫羊藿苷的平均回收率為98.04%，RSD值為2.49%。見表1。

表1 淫羊藿苷的加樣回收率測定結果

Tab.1 Results of icariin recovery test (n=6)

取樣量/g原有量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0.103 00.618 00.154 50.770 698.7798.042.490.120 60.723 60.180 90.898 696.740.106 70.640 20.320 10.956 898.910.102 10.612 60.306 30.921 7100.910.110 30.661 80.496 41.139 496.210.104 90.629 40.472 11.091 597.82

2.6淫羊藿及其配伍甘草后淫羊藿苷的含量變化 分別精密吸取2.3項下制備的供試品溶液(1～11) 5 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.1項下色譜條件進樣分析，所得圖譜共有10個共有峰，通過保留時間定性可知，7～10號峰組分來自淫羊藿(10號峰為淫羊藿苷)，3～6號峰組分來自甘草，1～2 號峰為淫羊藿與甘草的共有峰，色譜圖見圖2。

圖2 淫羊藿與甘草不同比例配伍的HPLC圖

1～10.特征峰；10.淫羊藿苷。

Fig.2 HPLC chromatogram ofEpimediumbrevicornuMaxim andGlycyrrhizaof different proportion compatibility

1-10.characteristic peaks;10.icariin.

由圖2可知，淫羊藿與甘草的配伍水煎液中各峰分離度較高、峰形較好、保留時間相對穩定，沒有新峰產生。其中相對峰面積為各水煎液中成分的峰面積除以淫羊藿單煎液中相對應成分的峰面積。淫羊藿苷等成分相對峰面積與不同配伍比例間的關系見表2。由表2可知，與甘草配伍后，淫羊藿中8和10號峰組分含量總體增加較為明顯，7和9號峰組分含量變化較小。結果表明，淫羊藿與甘草配伍比例為5∶1時，淫羊藿中淫羊藿苷等成分含量增加最明顯，且此時淫羊藿苷的含量達到最大值，為6.701 mg·g-1。

表2 淫羊藿苷等成分相對峰面積與不同配伍比例間的關系

Tab.2 The relationship between the relative peak area of icariin and other components and different proportions

峰號成分tR/min不同配伍比例(淫羊藿∶甘草)中淫羊藿苷的相對峰面積1∶06∶15∶14∶13∶12∶11∶11∶21∶31∶47未知4.51.0001.0131.0201.0151.1171.0121.0091.0111.0071.0058未知8.41.0001.1061.1401.0961.0871.0721.0231.0331.0291.0189未知9.31.0001.0321.0261.0201.0161.0121.0100.9941.0071.00310淫羊藿苷11.31.0001.0941.1051.0971.0381.0241.0120.9981.0020.999

3 討論

本實驗研究淫羊藿與甘草不同比例配伍對淫羊藿中主要化學成分含量變化的影響，實驗采用HPLC法進行測定，研究表明，淫羊藿與甘草配伍后并無新的化學物質生成，僅化學成分的含量發生改變。實驗對比研究了乙腈-1 mL·L-1磷酸、乙腈-水溶液、乙腈-2 mL·L-1冰醋酸，流速0.8和1.0 mL·min-1，柱溫20，25，30和35 ℃ 條件下的分離結果。結果顯示，乙腈-水溶液(70∶30)，流速為1.0 mL·min- 1，柱溫為25 ℃條件下分離效果最好。本次實驗對方法的精密度、重復性、穩定性以及線性范圍和回收率均作了考察，結果符合方法學要求。

現代藥理學研究表明，淫羊藿苷具有促進神經突觸生長、抵抗神經元損傷、改善骨代謝、抗炎、抗氧化應激、抗抑郁和抗腫瘤等作用[16-17]。通過對比淫羊藿與甘草不同比例配伍前后的水煎液，結果表明，淫羊藿與甘草配伍后淫羊藿中所含淫羊藿苷等4種成分含量總體比單味淫羊藿中4種成分含量高，推斷可能是二藥配伍后甘草皂苷的增溶作用[18-19]增加了水煎液中淫羊藿苷等成分的溶解度。當淫羊藿與甘草配伍比例為5∶1時更有利于淫羊藿苷成分的溶出，這一比例是淫羊藿和甘草藥材飲片的最佳配伍比例，對提高其生物利用度和療效等方面有重要作用。由于中藥配伍的復雜性,為了全面研究二藥的配伍關系,需深入考察。