復方扶正養肝顆粒的制備工藝研究

陳 坤，陳凌云，王華寧

(1.云南中醫學院，昆明 650500；2.云南省中醫醫院，昆明 650021)

扶正養肝湯由藍花參、黃芪、白術、柴胡、白芍和土茯苓等中藥組成，具有扶正固本、清熱利濕和解毒化濁之功效。該方為云南省中醫醫院脾胃病科治療病毒性肝炎的協定處方，前期臨床及實驗研究表明，扶正養肝方對病毒性肝炎患者肝功能具有較好的改善作用，能明顯降低刀豆蛋白A (Con A)誘導免疫性肝損傷模型小鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)，下調細胞因子IFN-γ表達[1-2]。該方原為湯劑，為使患者服用、攜帶方便，本研究擬將其開發成醫療機構制劑。

1 儀器與試藥

1.1儀器 1100Series高效液相色譜儀(包括四元梯度泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器和柱溫箱，美國安捷倫公司)；SK3300LH超聲儀(上?？茖С晝x器有限公司)；AB265-S分析天平[0.000 01 g，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Kromat Universil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，S/N:0J7U73，科瑞邁公司)；OSB-2100旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社)；數顯恒溫水浴鍋(北京永光明醫療儀器廠)；休止角測定儀(寧波海曙瑞柯儀器有限公司)。

1.2試藥 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111920-201606，質量分數≥98%)；可溶性淀粉、糊精、麥芽糊精以及水溶液性淀粉(藥用級,安徽山河藥物輔料有限公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司，批號1685730321)；甲酸(分析純，天津市化學試劑三廠，批號110108)；水為娃哈哈純凈水；黃芪、白芍和土茯苓等藥材均由云南省中醫醫院提供。

2 方法與結果

2.1扶正養肝顆粒提取工藝研究

2.1.1吸水率的考察 按中藥組方比例稱取1/2處方量飲片，每份72.5 g，共6份，每份加入水500 mL，分別浸泡15,30,45,60,75和90 min，濾凈飲片表面的可流動溶劑，并稱定浸泡后飲片的質量，比較浸泡后飲片的質量變化，以吸水率為評價指標，確定最佳浸泡時間，重復此過程3次，取平均值，結果表明，最佳浸泡時間為60 min，吸水率為125%。

2.1.2因素水平的確定 在預實驗以及查閱文獻的基礎上[3-8]，選擇加水倍數、提取時間和提取次數3個因素，以干膏得率和毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率綜合評分為指標進行考察，對實驗結果進行方差分析，考察各因素對實驗的影響程度大小，最終確定各參數的水平，據此選擇最佳提取工藝條件。因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素與水平

Tab.1 Orthogonal test factor and levels

水平因素A,加水倍數B,提取時間/hC,提取次數181.012101.523122.03

2.1.3評價指標 干浸膏得率：按照處方比例稱取飲片145 g，置于圓底燒瓶中，加適量水浸泡60 min，按正交表所列條件進行回流提取，濾液濃縮至約250 mL上述溶液，置于250 mL量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。精密吸取25 mL上述溶液，置于已干燥至恒質量的蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣置于105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置于干燥器中冷卻0.5 h，迅速稱定其質量，計算干浸膏得率。結果見表2。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率：色譜條件[9-12]：以乙腈-2 mL·L-1甲酸(13∶87)為流動相；柱溫為20 ℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為260 nm；理論板數以毛蕊異黃酮峰計算應不低于3 000。

2.1.4溶液的制備 對照品溶液:精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品，加甲醇溶解并稀釋成質量濃度為78 μg·mL-1的對照品溶液。

復方供試品溶液：稱取1倍處方量，回流提取，濾液濃縮，定容至刻度，精密吸取定容液25 mL，水浴濃縮至干，殘渣加甲醇定容至25 mL量瓶中，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

藥材供試品溶液：精密稱取黃芪粉末1 g，置于圓底燒瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流4 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取續濾液，即得[12]。

陰性對照溶液：按照處方比例制成缺黃芪的陰性樣品，按照復方供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.1.5專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、藥材供試品溶液、復方供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1，結果表明專屬性良好。

2.1.6線性與范圍 精密吸取對照品溶液2，5，10，15，20和25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積值為縱坐標(y)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷進樣量(μL)為橫坐標(x)進行線性回歸，標準曲線方程為y=3 048.3x-0.130 6(r=0.999 7)，結果表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量在0.156～1.95 μg間峰面積與進樣量呈良好的線性關系。

2.1.7精密度實驗 精密吸取2.1.4項下制備的對照品溶液10 μL，按照2.1.3項下色譜條件重復進樣6次，結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD值為0.23%，表明儀器精密度良好。

2.1.8重復性實驗 精密移取定容液25 mL，共6份，按照2.1.4項下復方供試品溶液制備方法處理，進行含量測定，計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的RSD值為1.57%。結果表明，該方法重復性良好。

圖1 HPLC圖

A.對照品溶液；B.藥材供試品溶液；C.復方供試品溶液；D.陰性對照溶液；1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference solution；B.herbs sample solution；C.compound sample solution；D.negative solution；1.calycosin-7-glucoside.

2.1.9穩定性實驗 精密吸取同一對照品以及供試品溶液，于1，2，4，8，12和24 h進樣10 μL，峰面積的RSD值分別為0.26%和1.32%。結果表明，穩定性良好。

2.1.10準確性實驗 精密吸取已知含量的同一供試品溶液1 mL，共9份，分別加入適量毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液，按照2.1.4項下復方供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照2.1.3項下色譜條件進樣分析，平均回收率為97.34%，RSD值為2.07%。結果表明，準確性良好。

2.1.11藥材含量測定 取3份黃芪飲片，按照《中國藥典》2015年版一部黃芪項下含量測定計算含量，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為0.433 2%(n=3)，符合藥典標準。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率=液相測得的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量÷0.433 2%×復方中黃芪藥材用量×100%

2.2正交實驗安排與結果 見表2和表3。

表2 正交實驗結果

Tab.2 The results of orthogonal experiment

實驗號因素ABCD干浸膏得率/%毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率/%綜合評分1111110.6551.2154.762122216.6070.2277.853133321.6489.63100.004212318.7574.3384.045223121.2458.6275.236231214.6663.4069.847313220.4172.4784.898321315.3161.8169.509332117.3182.8688.71K177.53774.56364.70072.900K276.37074.19383.53377.527K381.03386.18386.70784.513R4.66311.99022.00711.613

表3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率方差分析結果

Tab.3 The results of calycosin-7-glucoside transfer rate analysis of variance

因素偏差平方和自由度F比F臨界值PA33.33420.17219.000>0.05B278.92121.36019.000<0.05C849.05824.14019.000<0.05D(誤差)178.2202

注：F(2,2)0.05=19.00。

綜合評分：選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率及干浸膏得率的綜合評分為指標，權重系數分別為70%和30%。綜合評分=(毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率÷毛蕊異黃酮的最大值×0.7+干浸膏得率÷干浸膏得率的最大值×0.3)×100

根據直觀分析及方差分析結果可知，3個因素對綜合評分的影響大小為 C>B>A，即提取次數>提取時間>加水倍數，因此確定最佳提取工藝為 A3B3C3。

驗證實驗：為保證優選提取工藝的合理可行，對該工藝進行了3次驗證。取1倍處方量藥材3份，按照A3B3C3條件提取，測定干膏得率及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉移率，結果顯示，干浸膏得率分別為21.15%，20.98%和21.72%，相應的毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率分別為88.79%，89.36%和89.86%。

2.3扶正養肝顆粒的成型工藝

2.3.1劑型的選擇 扶正養肝顆粒由11味藥組成，臨床處方總量為145 g，以水煎湯服用2 d，每日3次，根據最佳提取工藝，計算出每日需服用浸膏質量15～16 g(相當于每次服用生藥24 g)。為了與臨床保持一致，本方工藝中采用了水提對原料進行處理。因根據本方功能主治特點及適應人群，結合處方中藥物成分理化性質，本次研發中選擇了顆粒劑。因本癥患者多伴有血糖高等癥狀，故選擇制成無糖型顆粒。

2.3.2濃縮、干燥工藝條件 為防止飲片夾帶的不溶性雜質對顆粒的溶化性檢測產生影響，濃縮前將提取液靜置12 h以上，濾過。濃縮工藝選擇常規的減壓濃縮，溫度為60～70 ℃，真空度為0.06～0.08 MPa，相對密度為1.20～1.25 (60 ℃)，以5 000 r·min-1離心20 min，濾過，再常壓濃縮至相對密度為1.30～1.35。

干燥工藝條件：干燥工藝采用將輔料與清膏混合干燥，用恒溫鼓風干燥的方法，溫度控制在65 ℃。

2.3.3輔料評價指標 以制備過程中的軟材情況、制粒情況、顆粒情況、顆粒一次收率和溶化性等作為指標對成型工藝進行評價。

顆粒一次收率=通過1號篩但不能通過5號篩的顆粒質量÷顆?？傎|量÷整粒前總質量×100%

2.3.4輔料的選擇 本方擬制成無糖型顆粒，分別考查了糊精、可溶性淀粉和水溶性淀粉對成型的影響。方法：稱取1倍處方量，所得稠膏均分成4份，分別加入30%稠膏量的糊精、麥芽糊精、可溶性淀粉和水溶性淀粉拌膏，平鋪在有相應輔料(用量為稠膏量10%)的烘盤中，65 ℃干燥，粉碎，過100目篩，得4份干膏粉，以體積分數為80%的乙醇為潤濕劑制成軟材，過1號篩制成顆粒，65 ℃干燥，整粒，觀察軟材情況，干顆粒性狀，檢查溶化性。結果見表4。

表4 單種輔料考察結果

Tab.4 Inspection results of one excipient

輔料軟材情況制粒情況顆粒情況顆粒一次收率/%溶化性糊精適中易制粒棕黑、均勻、硬度適中84.62不合格可溶性淀粉稍黏不易制粒棕黑、均勻、硬度稍硬84.37不合格麥芽糊精黏不易制粒棕黑、均勻、硬度適中76.45合格水溶性淀粉適中易制粒棕黑、均勻、顆粒脆80.58不合格

根據單一輔料考察結果，加入單一輔料后顆粒均不合格，故將不同配比的麥芽糊精和糊精混合，混合輔料與稠浸膏按照1∶0.4的比例混合。方法：稱取1倍處方量，將濃縮所得稠膏均分成5份，分別加入30%稠膏量的各比例混合輔料，同法操作。結果見表5。結果表明，選用糊精-麥芽糊精1∶2作為顆粒劑的賦形劑的顆粒一次收率最高。

表5 混合輔料考察結果

Tab.5 Inspection results of mixed excipients

糊精∶麥芽糊精軟材情況制粒情況顆粒情況顆粒一次收率/%溶化性1∶1適中易制粒棕黑、均勻、硬度適中85.43不合格1∶2適中易制粒棕黑、均勻、硬度適中86.68合格2∶1適中易制粒棕黑、均勻、硬度適中84.17不合格1∶3稍黏易制粒棕黑、均勻、硬度適中82.72合格3∶1適中易制粒棕黑、均勻、硬度適中82.39合格

2.3.5潤濕劑的考察 扶正養肝處方干膏粉的黏性較大，潤濕劑可選擇不同體積分數的乙醇。稱取1倍處方量，將所得稠膏均分成3份，分別加入30%稠膏量的糊精-麥芽糊精(1∶2)拌膏，均勻倒入鋪有糊精-麥芽糊精(1∶2，用量為稠膏量10%)的烘盤中，65 ℃干燥，粉碎，過100目篩，得3份干膏粉，以體積分數分別為70%，80%和90%的乙醇為潤濕劑制成軟材，過1號篩制成顆粒，65 ℃干燥，整粒，觀察軟材情況和干顆粒性狀，檢查溶化性。結果見表6。由表6可知，體積分數為80%的乙醇為潤濕劑結果最佳。

表6 潤濕劑乙醇體積分數考察結果

Tab.6 Inspection results of volume fraction in wetting agents

乙醇體積分數/%軟材情況制粒情況顆粒情況顆粒一次收率%溶化性70黏度大不易制粒棕黑、均勻、較硬82.65不合格80適中易制粒棕黑、均勻、硬度適中86.24合格90適中可制粒棕黑、均勻、硬度稍脆82.84合格

2.3.6潤濕劑用量的考察 稱取1倍處方量，將所得稠膏均分成4份，按照2.3.5項下方法得4份干膏粉，分別加入各份干膏粉總量的10%，15%，20%和25%的體積分數為80%的乙醇制成軟材，過1號篩制成顆粒，65 ℃干燥，整粒，觀察軟材情況和干顆粒性狀，檢查溶化性。結果見表7。結果表明，潤濕劑用量為15%時結果最佳。

表7 潤濕劑用量考察結果

Tab.7 Investigation results of dosage in wetting agents

潤濕劑用量/%軟材情況制粒情況顆粒情況顆粒一次收率/%溶化性10松、散可制粒棕黑、細粉多75.91合格15適中易制粒棕黑、均勻、硬度適中87.63合格20稍黏可制粒深棕黑、均勻、稍硬82.75合格25黏不易制粒深棕黑、顆粒硬71.96合格

2.3.7濕顆粒干燥時間考察 取制備好的濕顆粒1份，平鋪于小盤內，厚度1 cm，置于干燥箱內，65 ℃放入鼓風干燥箱，計算1.0，1.5，2.0和2.5 h后顆粒的水分含量，從而確定干燥時間。結果顆粒含水量分別為 7.94%， 6.52%，4.43%和2.74%。干燥2.5 h后，顆粒含水量為2.74%，符合《中國藥典》2015年版相關規定，從而確定復方扶正養肝顆粒的干燥時間為2.5 h。

2.3.8顆粒劑流動性的考察 采用固定漏斗法測定休止角，結果顯示，休止角均值為32.7°，表明顆粒的流動性良好。

2.3.9顆粒堆密度考察 將顆粒分次倒入10 mL量筒中，邊倒邊用洗耳球敲打均勻，加至10 mL，倒出，稱定質量，平行測3次。計算堆密度：ρ=m÷v。測定結果見表8。結果表明，顆粒的平均堆密度為0.64 g·mL-1。

2.3.10顆粒堆臨界相對濕度(CRH)的考查 稱取成品顆粒7份，每份2 g，置于干燥器內恒質量24 h，精密稱定，又分裝于7個已干燥至恒質量的稱量瓶中(不加蓋)，放入底部分別盛有不同濃度NaOH溶液的干燥器中，25 ℃下恒溫保存60 h，精密稱定，計算吸濕百分率，實驗重復1次，取平均吸濕百分率[13-15]。以相對濕度(RH)為橫坐標、吸濕率為縱坐標作圖，得CRH，結果顯示，成品的CRH為66%，見圖2。因此，在分裝及貯存時，環境相對濕度控制在68%以下為宜。

圖2 不同相對濕度下顆粒的吸濕率

Fig.2 Hygroscopic rates in different RH

2.4工藝驗證 按照處方比例稱取中藥飲片；加10倍量水浸泡60 min后，首次加1.25倍水，煎煮2 h，濾過，同法3次，合并3次濾液，靜置過夜，濾過，減壓濃縮至相對密度為1.20～1.25 (60 ℃)，以5 000 r·min-1離心20 min，常壓濃縮至相對密度為1.30～1.35 (60 ℃)，取稠膏備用，將上述稠膏與30%稠膏量糊精-麥芽糊精(1∶2)拌膏，均勻倒入平鋪有糊精-麥芽糊精(1∶2，用量為稠膏量10%)的烘盤中，65 ℃干燥，粉碎，過100目篩，得干膏粉，備用，以15%總干膏粉量的體積分數為80%的乙醇為潤濕劑，制備軟材，制粒，65 ℃干燥2.5 h，整粒，制得無糖型顆粒，進行外包裝。

驗證結果表明，按處方比例稱取標準處方量飲片2 900 g，按照2.4項下工藝流程進行3次工藝驗證，批號分別為20170501，20170502和20170503，結果見表8。實驗結果表明，3批樣品制備過程中各指標重復性較好，說明所確定的工藝穩定，可用于復方扶正養肝顆粒的生產。

表8 工藝驗證結果

Tab.8 Verification of process technology

項目批號201705012017050220170503提取投料量/g2 9002 9002 900提取液毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率/%88.1287.7687.54稠膏質量/g707675721糊精-麥芽糊精總用量/g285268286干顆粒堆密度/g0.650.660.65干顆粒休止角/°30.0531.6031.32干顆粒水分含量/%2.852.792.65顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率/%82.6482.3882.05

3 討論

本方中黃芪、白芍和土茯苓等主要有效成分為苷類[16]，垂盆草、茵陳和甘草等的主要有效成分為黃酮有機酸類[17]，郁金的主要有效成分為揮發油和多糖[18]，薏苡仁的主要有效成分為多糖、酯類及脂肪酸[19]，丹皮的主要有效成分為丹皮酚及芍藥苷，丹參的主要成分為丹酚酸B，這些成分均有較好的水溶性，故整個處方采用水提。

黃芪作為君藥，按照《中國藥典》2015年版一部規定，應檢測黃芪中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，黃芪甲苷用水難以提取，且檢測需蒸發光散射檢測器，故選用毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為評價指標。

本方成型工藝的原料為稠膏，由于稠膏量較大，干法制粒和稠膏制粒的可行性較小，因此，采用在稠膏中加入部分輔料，拌膏后進行干燥，經多次實驗表明，以加入稠膏質量的40%為宜，65 ℃干燥，時間為12 h。