比卡魯胺聯合塞來昔布對前列腺癌細胞LNCaP增殖的影響

白曉黎，王 麗，謝秀娟，陳宏偉

(1.河南科技大學第一附屬醫院藥品調劑科，洛陽 471003；2.鄭州大學附屬洛陽中心醫院，洛陽 471000)

近年來，前列腺癌在全球的發病率和死亡率逐漸增加[1-2]，其治療面臨極大的挑戰[3-5]。比卡魯胺是一種新型非甾體抗雄激素受體制劑，對前列腺癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用，已應用于臨床[6-7]。塞來昔布是一種COX-2的抑制劑，在治療前列腺炎及前列腺癌中具有較好的應用[8-10]。本研究擬培養前列腺癌LNCaP細胞，給予比卡魯胺、塞來昔布及二者聯合干預后，采用MTT法測定細胞生長的抑制情況，化學發光法檢測細胞培養液中總前列腺特異抗原(PSA)的濃度，流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率，Western Blot檢測各組細胞Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達情況。

1 儀器與材料

1.1儀器 流式細胞儀(美國BD公司)；細胞培養箱(美國Thermo公司)；電泳儀、電轉移裝置(美國BIO-RAD公司)；酶標儀(美國BIOTEK公司)；超聲細胞破碎儀(寧波新芝公司)。

1.2材料 比卡魯胺和塞來昔布(輝瑞制藥公司，批號分別為H20100309和J20140072)；胰蛋白酶、胎牛血清、F12培養基和Western Blot試劑盒(批號SC-1004,北京中杉生物公司)；ECL試劑盒(Pierce公司，批號NCI4106);Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號C1062S)；驢抗兔、Caspase 3和Caspase 8抗體(批號分別為ab13847和ab25901,Abcam公司)。TBST由實驗室自制；前列腺癌細胞LNCaP(上海生命科學院細胞庫，批號CRL-1740),培養于含90%的F12培養液、體積分數為10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 u·mL-1的培養基中，培養環境為37 ℃、體積分數為5%的CO2，常規培養。2 d換液1次，8 d用胰蛋白酶進行消化傳代1次。

2 方法

2.1細胞MTT測試 MTT按照3×104個細胞·孔-1的規格接種至96孔板中，在37 ℃和體積分數為5%的CO2環境中培養。取處于生長對數期的細胞，分別加入50 μmol·L-1比卡魯胺、40 μmol·L-1塞來昔布以及50 μmol·L-1比卡魯胺聯合40 μmol·L-1塞來昔布，對照組不加處理因素。作用于前列腺癌LNCaP細胞24，48 和72 h。終止培養4 h前加入質量濃度為5 g·L-1的MTT 10 μL，4 h后棄上清液，留下MTT結晶，用DMSO進行溶解，在波長為570 nm，參考波長為630 nm處，用Biotek EJ309酶標儀檢測吸光度值A，每組重復3次取平均值，以空白組吸光度值A為0，計算生長抑制率。細胞生長抑制率=1-(實驗組吸光度值A-對照組吸光度值A)×100%。

2.2細胞凋亡率的測定 依照2.1項下方法操作，作用于細胞48 h后，收集所有細胞，以1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入新鮮配制的PBS緩沖液(pH=7.4)3 mL，沖洗2次，離心5 min，棄上清液，將細胞重懸于Binding Buffer 200 μL，Annexin V-FITC 10 μL和PI 5 μL中，輕盈混勻，遮光反應15 min，加入Binding Buffer 300 μL，1 h內檢測細胞凋亡率。

2.3Western Blot 依照2.1項下方法操作，作用于細胞48 h后，收集所有細胞，用PBS緩沖液洗滌，添加富含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的強效細胞裂解液，用超聲細胞破碎儀破碎細胞，BCA法進行蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，隨后電轉至PVDF膜上，Caspase 3和Caspase 8抗體(均為1∶500)進行孵育，4 ℃放置24 h后用TBST洗滌3次，加入HRP標記的驢抗兔IgG(1∶500)，ECL試劑盒曝光，系統ImageLab軟件對條帶進行灰度分析，并計算與內參蛋白β-actin的相對值。

3 結果

3.14組不同時間點前列腺癌LNCaP細胞的生長抑制率 對照組的生長抑制率均為0，各給藥組的生長抑制率結果見表1。進一步對組間細胞的生長抑制率進行比較，聯合組顯著優于比卡魯胺組和塞來昔布組(P<0.05)。

表1 4組不同時間點前列腺癌LNCaP細胞的生長抑制率

組別不同時間(h)細胞的生長抑制率/%244872對照組000比卡魯胺組32.91±3.2145.09±3.0453.92±4.12塞來昔布組35.18±2.7947.16±3.3356.12±3.26聯合組43.76±3.18?#63.11±2.98?#69.97±4.15?#F261.94503.43424.13P0.000.000.00

注：與塞來昔布組比較*P<0.05；與比卡魯胺組比較#P<0.05。

3.24組細胞培養液中總前列腺特異抗原(PSA)的變化 與對照組比較，比卡魯胺組、塞來昔布組以及聯合組的PSA濃度明顯降低，其中聯合組對PSA的抑制程度明顯優于比卡魯胺組和塞來昔布組(P<0.05)。見圖1。

3.34組不同時間點前列腺癌LNCaP細胞的凋亡率比較 進一步對組間細胞的凋亡率進行比較，聯合組顯著優于比卡魯胺組和塞來昔布組(P<0.05)。見表2。

3.44組細胞Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達情況 與對照組相比，比卡魯胺組、塞來昔布組和聯合組Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達水平均顯著升高，聯合組Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達水平明顯高于比卡魯胺組和塞來昔布組(P<0.05)。見圖2。

圖1 4組細胞培養液中總前列腺特異抗原的變化

注：與對照組比較*P<0.05；與比卡魯胺組比較#P<0.05；與塞來昔布組比較&P<0.05。

Fig.1 Changes of total prostate specific antigen in 4 groups of cell culture fluids

Note：*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs bicalutamide group；&P<0.05 vs celecoxib group.

表2 4組不同時間點前列腺癌LNCaP細胞的凋亡率

組別不同時間(h)細胞的凋亡率/%244872對照組1.45±0.113.12±0.212.14±0.13比卡魯胺組22.11±1.3136.19±2.0851.12±3.21塞來昔布組26.19±2.1942.11±3.0256.72±3.82聯合組33.13±1.28?#56.12±3.16?#66.67±3.25?#F455.07429.61465.78P0.000.000.00

注：與塞來昔布組比較*P<0.05；與比卡魯胺組比較#P<0.05。

圖2 4組細胞Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達情況

注：與對照組比較*P<0.05；與比卡魯胺組比較#P<0.05；與塞來昔布組比較&P<0.05。

Fig.2 Expression of Caspase 3 and Caspase 8 proteins in 4 groups of cells

Note：*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs bicalutamide group；&P<0.05 vs celecoxib group.

4 討論

比卡魯胺對前列腺癌細胞LNCaP具有顯著的生長抑制作用[11-12]。研究表明，比卡魯胺聯合塞來昔布存在協同作用，可抑制LNCaP細胞的增殖，誘導凋亡；其作用可能通過Caspase 3介導[13]。在體外培養條件下，睪酮對LNCaP-FCG細胞的生長依濃度關系呈雙向作用，比卡魯胺依濃度關系抑制LNCaP-FCG細胞的生長[11]。塞來昔布可通過調控凋亡蛋白的表達抑制腫瘤細胞的增殖[14-15]。研究表明，塞來昔布作為選擇性COX-2抑制劑可誘導激素非依賴性前列腺癌DU-145細胞凋亡，并首次對腫瘤的侵襲能力進一步探討，證實塞來昔布通過降低腫瘤細胞侵襲能力從而增加其抗腫瘤的作用[16-17]。研究顯示，對照組在24，48和72 h的細胞生長抑制率均為0。與對照組相比，比卡魯胺組、塞來昔布組和聯合組在24，48和72 h的生長抑制率明顯較高。進一步對組間細胞的生長抑制率進行比較，聯合組顯著優于比卡魯胺組和塞來昔布組，這與既往研究報道較為一致[11，18-19]。化學發光法檢測顯示，與對照組相比，比卡魯胺組、塞來昔布組以及聯合組的PSA濃度明顯降低，其中聯合組對PSA的抑制程度明顯優于比卡魯胺組和塞來昔布組。PSA作為診斷及治療前列腺癌的敏感性指標，在聯合組中的表達得到有效的抑制，提示聯合比卡魯胺與塞來昔布可有效抑制腫瘤細胞的活性，這與既往研究較為一致[20-21]。流式細胞儀檢測結果顯示，對照組在24，48和72 h的細胞凋亡率均低于比卡魯胺組、塞來昔布組和聯合組在24，48和72 h的生長抑制率。進一步對組間細胞的生長抑制率進行比較，聯合組顯著優于比卡魯胺組和塞來昔布組，符合預期。Western Blot結果提示，與對照組相比，給藥組Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達水平均顯著升高，聯合組Caspase 3和Caspase 8蛋白表達水平明顯高于比卡魯胺組和塞來昔布組。提示比卡魯胺聯合塞來昔布抑制前列腺癌細胞的生長抑制率以及促進腫瘤細胞凋亡的機制可能與促進細胞內Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達有關，這與本實驗預期結果較為一致。

綜上所述，比卡魯胺聯合塞來昔布能有效抑制前列腺癌細胞LNCaP的增殖，其機制可能與促進凋亡相關蛋白Caspase 3和Caspase 8進而促進腫瘤細胞的凋亡有關，有望為臨床治療前列腺癌帶來新思路。