HPLC-MS/MS法測定人血漿中阿莫西林的質量濃度

陳冠華，江 羽，雷后亮*

(1.浙江金華康恩貝生物制藥有限公司，金華 321016；2.天堃醫藥科技(杭州)有限公司，杭州 310000)

阿莫西林是一種治療細菌性感染常用的β-內酰胺類半合成青霉素[1]，由英國Beecham公司最早開發生產。我國自1982年開始批準生產阿莫西林單方制劑，目前上市的主要是片劑、膠囊劑和粉針劑等，是應用較為廣泛的口服青霉素之一，以膠囊劑為主[2]，其臨床效果明顯、療效確切，是各種抗生素中最引人關注、發展最快的品種之一。

目前阿莫西林血藥質量濃度的主要測定方法為HPLC法[3-10]和微生物法[11]，但2個方法均靈敏度較低。因此，本研究建立了一種快速、高效測定人血漿中阿莫西林血藥質量濃度的HPLC-MS/MS方法，成功應用于阿莫西林膠囊人體生物等效性研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津LCMS-8050液質聯用儀(包括DGU-20A5R脫氣機、LC-30AD二元高壓泵、CTO-30A柱溫箱、SIL-30ACMP自動進樣器、LCMS-8050三重四極桿質譜儀和ATN-1050氮氣發生器)，Labsolution CS數據采集工作站Version 6.72，AUW-120D電子天平(日本島津公司)；SIGMA 2-16KL高速冷凍離心機(SIGMA公司)；Milli-Q?超純水系統(Millipore公司)；多管渦旋振蕩器(SCDEALL儀器設備公司)；New Brunswick超低溫冰箱(Eppendorf公司)。

1.2試藥 甲醇(色譜純，Merck公司，批號I844207633)；甲酸[色譜純，阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號F1627037]；超純水(Milli-Q?超純水系統制備，Millipore公司)；阿莫西林對照品(批號130409-201512，質量分數為86.9%，中國食品藥品檢定研究院)；阿莫西林-d4對照品(批號7-YHH-23-1，質量分數為96%，多倫多化學研究公司)；阿莫西林膠囊受試制劑(規格0.25 g，浙江金華康恩貝生物制藥有限公司)；阿莫西林膠囊參比制劑(規格0.25 g，葛蘭素史克公司)。

2 方法與結果

2.1色譜-質譜條件

2.1.1色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-Aq (150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；保護柱：Inert Sustain C18(10 mm×4.0 mm，5.0 μm)；流動相：甲醇-2 mL·L-1甲酸溶液(40∶60)；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；進樣室溫度：4 ℃。

2.1.2質譜條件 大氣壓電噴霧離子源(ESI)，負離子模式；多重反應選擇離子監測(MRM)；接口電壓：-3 000 V；接口溫度：300 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；DL溫度：250 ℃；霧化氣流量：3 L·min-1；加熱氣流量：10 L·min-1；干燥氣流量：10 L·min-1。

阿莫西林定量母離子及子離子為：m/z364→223(停留時間：100 ms，Q1電壓=18.0 V，碰撞能量=11.0 V，Q3電壓=25.0 V)。阿莫西林-d4定量母離子及子離子為：m/z368→227(停留時間：100 ms，Q1電壓=18.0 V，碰撞能量=12.0 V，Q3電壓=23.0 V)。

2.2溶液的配制

2.2.1樣品的預處理 取血漿樣品100 μL，置于1.5 mL離心管中，分別加入體積分數為50%的甲醇溶液5 μL和2.2.3項下制備的阿莫西林-d4內標溶液5 μL，混勻，加入1 000 μL甲醇，渦旋30 s，以13 000 r·min-1離心5 min(4 ℃)，取上清液2 μL，進樣分析。

2.2.2阿莫西林對照品儲備液 精密稱取阿莫西林對照品22.65 mg,置于20 mL量瓶中，用適量體積分數為50%的甲醇溶液超聲溶解并定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.984 1 mg·mL-1的阿莫西林對照品儲備液,于4 ℃避光保存，備用。

2.2.3阿莫西林-d4內標溶液 精密稱取阿莫西林-d4對照品1.00 mg,置于10 mL量瓶中，用適量體積分數為50%的甲醇溶液超聲溶解并定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為100 μg·mL-1的內標溶液，于4 ℃避光保存，備用。

2.3專屬性 取6份不同來源未混合的空白血漿，除不加內標外，其他按照2.2項下方法操作，得色譜圖1A；再將一定質量濃度的阿莫西林對照品儲備液和阿莫西林-d4內標溶液加入空白血漿中，得色譜圖1B；另取健康受試者給藥后收集的血漿樣品，同法操作，得色譜圖1C。結果表明，阿莫西林和內標阿莫西林-d4的保留時間均為2.6 min，空白血漿中內源性物質不干擾待測物阿莫西林和內標阿莫西林-d4的測定。

2.4標準曲線與定量下限 取2.2.2項下制備的阿莫西林對照品儲備液，用體積分數為50%的甲醇稀釋成質量濃度分別為1.771，9.841，19.680，39.370，98.410，196.800，393.700和787.300 μg·mL-1的系列對照品溶液。分別吸取上述系列溶液各5 μL，精密加入空白血漿100 μL，按照2.2項下方法操作并分析，以待測物與內標質量濃度比為橫坐標(x)、待測物與內標峰面積比為縱坐標(y)，用加權(W=1/C2)最小二乘法進行回歸運算，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：y=2.567 6x-0.001 3，r=0.999 5。線性范圍為0.088 57～39.370 00 μg·mL-1，定量下限為0.088 57 μg·mL-1。

2.5精密度與準確度 取空白血漿100 μL，分別加入5 μL阿莫西林系列對照品溶液，配制相當于阿莫西林血藥質量濃度分別為0.089 21，0.178 40，3.568 00和35.680 00 μg·mL-1的定量下限、低、中和高4個質量濃度水平的樣品，各質量濃度平行6份，除不加5 μL體積分數為50%的甲醇外，按照2.2項下方法操作并分析，計算日內精密度和準確度，連續考察3 d，計算日間、日內精密度和準確度。結果見表1。由表1可知，日內精密度和日間精密度RSD值均小于15%，準確度均在104.0%～111.4%之間。

表1 阿莫西林日內和日間精密度

Tab.1 Determination of intra-day and inter-day precision of amoxicillin

血藥質量濃度/μg·mL-1準確度/%日內日間精密度/%日內日間0.089 21104.0～111.4107.82.67～4.634.530.178 40105.4～107.5106.22.73～3.363.093.568 00104.0～105.1104.70.81～2.021.5035.680 00106.3～108.0107.00.94～3.051.99

圖1 HPLC-MS/MS圖

A.空白血漿；B.空白血漿加入阿莫西林和阿莫西林-d4；C.受試者血漿樣品；Ⅰ.阿莫西林；Ⅱ.阿莫西林-d4。

Fig.1 HPLC-MS/MS chromatograms

A.blank plasma；B.blank plasma spiked with amoxicillin and amoxicillin-d4； C.plasma sample after amoxicillin administration；Ⅰ.amoxicillin； Ⅱ.amoxicillin-d4.

2.6基質效應 取6份不同來源未混合的空白血漿，按照2.2.1項下方法預處理，得到空白樣品基質后再加入待測物和阿莫西林-d4內標溶液，配制低、中和高3個質量濃度水平的樣品進樣分析。另外用純水配制低、中和高3個質量濃度水平純溶液樣品進樣分析。計算經內標校正后的歸一化基質效應因子與RSD值。阿莫西林3個質量濃度水平對應的歸一化基質效應因子分別為0.99，0.97和0.95，RSD值分別為3.10%，1.85%和1.86%，表明基質不干擾檢測。

2.7提取回收率 用空白血漿配制含阿莫西林低、中和高質量濃度(0.178 40，3.568 00和35.680 00 μg·mL-1)的標準血漿樣品各6份，按照2.2項下方法預處理后進樣分析。另取用體積分數為50%的甲醇配制的阿莫西林低、中和高質量濃度(0.178 40，3.568 00和35.680 00 μg·mL-1)各6份，同上操作，進樣分析。比較2組樣品的峰面積，計算提取回收率。阿莫西林的提取回收率為81.6%～87.4%，阿莫西林-d4內標溶液的提取回收率為85.7%。

2.8樣品的穩定性

2.8.1全血樣品在室溫放置下的穩定性 用新鮮采集的全血配制低和高2個質量濃度全血樣品，各質量濃度6份，室溫放置1 h后以3 000 r·min-1離心10 min，得血漿，并按照2.2.1項下方法預處理后分析；另新鮮配制低和高2個質量濃度全血樣品，立即按照上述方法處理后分析。以待測物和阿莫西林-d4內標溶液峰面積的比值作為比較對象，考察全血樣品在室溫下放置的穩定性。結果見表2。由表2可知，低和高2個質量濃度樣品平均準確度分別為101.0%和104.5%，表明全血樣品在室溫放置1 h穩定。

2.8.2血漿樣品在室溫放置的穩定性 配制低和高2個質量濃度的血漿樣品，各質量濃度6份，室溫放置5 h后按照2.2.1項下方法預處理后分析；分析結果與所配質控的理論值比較，考察血漿樣品在室溫下放置的穩定性。由表2可知，低和高質量濃度樣品平均準確度分別為104.4%和104.5%。結果表明，血漿樣品室溫下放置5 h穩定。

2.8.3制備后樣品穩定性 當日制備的低、高質量濃度質控樣品測定后，將質控樣品(各質量濃度6份)置于進樣室(4 ℃)內放置48 h后用新鮮配制并處理的標準曲線和隨行質控進行分析測定，所得結果與所配質控的理論值比較，考察樣品處理后進樣室放置的穩定性。由表2可知，低和高2個質量濃度樣品平均準確度分別為102.5%和107.8%。結果表明，樣品制備后進樣室放置48 h穩定。

2.8.4血漿樣品凍融穩定性 配制低和高2個質量濃度的血漿樣品，各質量濃度6份，在-70 ℃下每次冷凍超過24 h，室溫解凍，完全解凍后渦流混勻，重復3次，按照2.2.1項下方法預處理并分析，考察樣品反復凍融3次的穩定性。由表2可知，低和高2個質量濃度樣品平均準確度分別為110.5%和110.3%。結果表明，血漿樣品凍融3次穩定。

2.8.5血漿樣品-20 ℃凍存穩定性 配制低和高2個質量濃度的血漿樣品，各質量濃度6份，在-20 ℃下冷凍保存。于凍存第5天取出，室溫解凍，按照2.2.1項下方法預處理后進行分析，考察血漿樣品-20 ℃凍存穩定性。由表2可知，低和高2個質量濃度樣品平均準確度分別為106.1%和105.0%。結果表明，血漿樣品在-20 ℃凍存5 d穩定。

表2 穩定性實驗結果

Tab.2 Results of stability test

質量濃度/μg·mL-1全血樣品室溫放置穩定性平均準確度/%RSD/%血漿樣品室溫放置穩定性平均準確度/%RSD/%制備后樣品穩定性平均準確度/%RSD/%血漿樣品凍融穩定性平均準確度/%RSD/%血漿樣品-20 ℃凍存穩定性平均準確度/%RSD/%血漿樣品-70 ℃凍存穩定性平均準確度/%RSD/%0.178 40101.03.22104.42.50102.52.82110.52.38106.13.0292.93.5435.680 00104.52.57104.51.55107.81.32110.31.42105.01.1397.01.95

2.8.6血漿樣品-70 ℃凍存穩定性 配制低和高2個質量濃度血漿樣品，各質量濃度6份，在-70 ℃下冷凍保存。于凍存第31天取出，室溫解凍，按照2.2.1項下方法預處理后進行分析，考察血漿樣品在-70 ℃凍存的穩定性。由表2可知，低和高2個質量濃度樣品平均準確度分別為92.9%和97.0%。結果表明，血漿樣品-70 ℃凍存31 d穩定。

2.9方法應用與數據分析 健康受試者空腹/餐后口服阿莫西林膠囊受試制劑和參比制劑后的平均血藥質量濃度-時間曲線見圖2。藥代動力學參數生物等效性評價結果見表3。根據國家藥品監督管理局(CFDA)的生物等效性評價方法，空腹和餐后藥代動力學參數均在80%～125%范圍內，認為受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

表3 健康受試者空腹/餐后口服阿莫西林藥代動力學參數

Tab.3 The bioequivalence results of amoxicillin in healthy subjects (fasting/after the meal)

參數參比制劑仿制制劑空腹Cmax/μg·mL-14.68±1.264.97±1.28t1/2/h1.21±0.241.18±0.21tmax/h1.86±0.681.67±0.45AUC0～t/h·μg·mL-113.83±2.7013.72±2.69AUC0～∞/h·μg·mL-114.17±2.6914.01±2.67餐后Cmax/μg·mL-13.94±0.873.95±1.13t1/2/h1.20±0.171.21±0.15tmax/h3.25±1.132.72±0.73AUC0～t/h·μg·mL-112.05±2.1611.91±2.42AUC0～∞/h·μg·mL-112.30±2.1912.20±2.40

圖2 健康受試者口服阿莫西林的平均血藥質量濃度-時間曲線

A.空腹；B.餐后。

Fig.2 Mean concentration-time curve of amoxicillin in healthy subjects

A.fasting;B.after the meal.

3 討論

文獻報道，測定生物樣品中阿莫西林多采用HPLC法[12-14]，但前處理過程較為繁瑣，檢測靈敏度低且樣品分析時間較長。隨著HPLC-MS/MS聯用儀的普及及其專屬性強、靈敏度高等優勢，該方法在生物樣品檢測、藥代動力學研究等方面應用日益廣泛。故本研究開發了高效靈敏的HPLC-MS/MS法用于血漿中阿莫西林血藥質量濃度的檢測。

由于阿莫西林極性較大、熱穩定性低，在一些常用的有機萃取劑中溶解度小，不易通過液-液萃取后復溶來收集樣品。在樣品的處理方法上，本研究采用蛋白沉淀法。在嘗試多種有機溶劑后，選擇用甲醇作為沉淀劑，蛋白沉淀較完全，基質干擾小，靈敏度高且毒性較低。建立的HPLC-MS/MS法經過全面的方法學驗證，穩定可靠、簡便高效，可成功應用于阿莫西林膠囊人體生物等效性研究。