紅芪復方對CCl4致小鼠肝損傷防治作用的篩方研究

楊亞飛,楊秀艷,薛志遠,方瑤瑤,周湘琳,趙良功，封士蘭*

(1.蘭州大學藥學院，蘭州 730000；2.蘭州大學第二醫院，蘭州 730000)

舒肝消積丸是國醫名師周信有的臨床經驗方，對乙型肝炎具有顯著療效[1]，同時能調節機體免疫[2]、抗肝損傷和促進肝損傷的修復[3]。在舒肝消積丸的處方配比基礎上，總結了4個紅芪復方經驗方，紅芪為主藥，由紅芪、丹參、郁金、柴胡、當歸、莪術、茵陳、板藍根、五味子和女貞子等中藥組成。紅芪(RadixHedysari)也稱為獨根，為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根，是甘肅道地藥材。本實驗選取4個紅芪復方經驗方，用四氯化碳(CCl4)致小鼠肝損傷，篩選對肝損傷防治效果最佳的紅芪復方。

1 儀器與材料

1.1儀器 KQ3200DE 數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BP211D電子天平(德國賽多利斯公司)；FA2104 電子天平(上海市安亭電子儀器廠)；550酶聯免疫檢測儀(美國Bio-Rad 公司)；UV-1700 紫外分光檢測儀(日本島津公司)；DP73顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)

1.2試藥 聯苯雙酯滴丸(萬邦德制藥集團股份有限公司，批號20151019，規格：1.5 mg·粒-1)。所有藥材均購于蘭州惠仁堂大藥房，經蘭州大學生藥學研究所馬志剛教授鑒定為正品。4個紅芪復方的組成分別為：紅芪復方一:紅芪、丹參、郁金和柴胡；紅芪復方二:紅芪、丹參、郁金、柴胡和五味子；紅芪復方三：紅芪、茵陳、丹參、女貞子和莪術；紅芪復方四：紅芪、丹參、當歸、板藍根和五味子。各復方分別加入藥材總量的8倍量水，煎煮3次，每次1.5 h，合并煎煮液，濃縮得浸膏。四氯化碳(CCl4，天津市大茂化學試劑廠)；花生油(山東魯花集團有限公司)；考馬斯亮藍試劑盒(批號20170421)、谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒(批號20170425)、谷草轉氨酶(AST)試劑盒(批號20170425)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20170424)和丙二醛(MDA)試劑盒(批號20170424)，蘇木素-伊紅(HE)染液(批號20170425)，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3實驗動物 昆明種小鼠，雄性，體質量為20±2 g，合格證號：SCXK(甘)-20130002，由蘭州大學實驗動物中心提供。

2 方法

2.1動物分組及給藥 取雄性昆明種小鼠84 只，適應性飼養1周后，隨機分為空白組、模型組、陽性對照組和4個紅芪復方組，每組12 只。模型組按照10 mL·kg-1皮下注射CCl4-花生油溶液(2∶8) 造小鼠肝損傷模型，每周1次，連續7周，形成肝損傷。除空白組外，各組均按照模型組同法造模。造模同時，陽性對照組每天灌胃聯苯雙酯滴丸(100 mg·kg-1)，4個給藥組每天給予紅芪復方(原藥材20 g·kg-1)灌胃，空白組和模型組每天給予生理鹽水，劑量為10 mL·kg-1，連續7周。末次給藥后禁食24 h，摘眼球，取血，以3 000 r·min-1離心，靜置10 min，分離出血清。采血后處死小鼠，取部分肝左葉，置于3.6 mol·L-1甲醛水溶液(體積分數為10%的福爾馬林溶液)中固定，剩余肝左葉置于凍存管中，在-80 ℃冰箱中凍存備用。

2.2檢測指標和檢測方法

2.2.1血清ALT和AST的活性測定 嚴格按照試劑盒說明書步驟進行測定。

2.2.2肝組織SOD 活力及 MDA 含量的測定 取一部分肝臟組織，用生理鹽水制成質量濃度為0.1 g·mL-1的肝組織勻漿，按照試劑盒說明書方法操作，檢測肝組織中蛋白質含量、SOD的活力和MDA 的含量。

2.2.3肝組織病理學觀察 多聚甲醛固定后的肝組織經常規脫水、石蠟包埋、切片后，用HE染色，觀察肝組織病理學變化。

2.3數據處理 實驗數據以x±s表示，采用SPSS 19.0 軟件統計，組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1對CCl4誘導的肝損傷小鼠體質量的影響 與空白組比較，模型組小鼠的體質量明顯降低(P<0.05)，說明CCl4造模會降低小鼠體質量。與模型組比較，陽性對照組和各紅芪復方組小鼠體質量變化差異均無統計學意義，說明本實驗條件下陽性對照組和紅芪復方各組對小鼠的體質量無明顯影響。見表1。

3.2對CCl4誘導的肝損傷小鼠肝臟指數的影響 與空白組比較，模型組小鼠的肝臟指數明顯升高(P<0.05)，說明CCl4造模會升高小鼠肝臟指數。與模型組比較，陽性對照組和各紅芪復方組小鼠肝臟指數變化差異均無統計學意義，說明本實驗條件下陽性對照組和紅芪復方各組對小鼠的肝臟指數無明顯影響。見表1。

3.3對CCl4誘導的肝損傷小鼠 ALT和AST含量的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清 ALT和AST 水平明顯升高，差異有顯著統計學意義(P<0.05)，說明CCl4誘導小鼠肝損傷的模型建立成功;與模型組比較，陽性對照組和紅芪復方各組ALT和AST水平明顯降低(P<0.05)。與陽性對照組比較，紅芪復方三組ALT差異有顯著統計學意義(P<0.05)，且更能降低ALT水平，AST水平比較差異無統計學意義，表明紅芪復方三組效果最佳。見表2。

表1 紅芪復方對CCl4誘導的肝損傷小鼠肝臟指數的影響

組別劑量/g·kg-1體質量/g肝質量/g肝臟指數/mg·g-1空白組37.98±3.801.31±0.2234.51±4.07模型組31.89±6.78?1.87±0.56?58.12±10.10?陽性對照組0.133.28±5.142.04±0.4561.01±8.91紅芪復方一組2033.31±5.421.97±0.2959.77±7.13紅芪復方二組2034.78±4.852.11±0.2861.01±4.34紅芪復方三組2033.99±3.962.10±0.3162.11±8.37紅芪復方四組2035.80±5.622.12±0.3159.87±7.37

注:與空白組比較*P<0.05。

表2 紅芪復方對CCl4誘導的肝損傷小鼠血清ALT和AST含量的影響

組別劑量/g·kg-1ALT水平/U·L-1AST水平/U·L-1空白組37.33±11.06117.34±19.39模型組152.42±16.55?270.58±21.41?陽性對照組0.180.05±11.68#158.19±21.64#紅芪復方一組2099.28±15.22#△189.10±16.27#△紅芪復方二組2067.55±12.48#△204.73±16.67#△紅芪復方三組2058.05±10.59#△162.42±18.06#紅芪復方四組20125.05±9.30#△220.57±17.90#△

注:與空白組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；與陽性對照組比較△P<0.05。

3.4對CCl4誘導的肝損傷小鼠肝組織勻漿SOD和MDA的影響 與空白組比較，模型組肝組織SOD 活性明顯降低(P<0.05)，小鼠肝組織的 MDA 含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和各紅芪復方組均能明顯升高SOD活性(P<0.05)以及降低肝組織MDA含量。與陽性對照組比較，紅芪復方三組SOD 和MDA差異均無統計學意義，表明紅芪復方三組與陽性對照組效果無差異。見表3。

表3 紅芪復方對CCl4誘導的肝損傷小鼠肝組織勻漿SOD和MDA的影響

組別劑量/g·kg-1SOD水平/U·mgprot-1MDA水平/nmol·mgprot-1空白組181.91±30.131.48±0.63模型組123.15±31.90?3.26±1.20?陽性對照組0.1220.39±41.89#2.43±0.73#紅芪復方一組20269.11±43.41#△1.80±0.95#紅芪復方二組20242.18±48.11#2.08±1.08#紅芪復方三組20203.06±41.15#2.21±0.73#紅芪復方四組20206.00±35.30#2.39±0.55#

注:與空白組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05;與陽性對照組比較△P<0.05。

3.5對CCl4誘導的肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響 肝組織切片經HE 染色后，在光鏡下觀察，空白組小鼠肝組織清晰，肝小葉結構完整，肝細胞呈放射狀排列，匯管區清楚。模型組小鼠肝細胞發生空泡樣變，水腫嚴重，脂肪變性，排列不規整，可見少量灶狀壞死，是典型的肝損傷病理特征，說明CCl4造模成功。與模型組比較，陽性對照組和各紅芪復方組細胞腫脹范圍、變性程度和肝組織壞死區域等病理性損傷均有不同程度的減輕，以紅芪復方三組損傷程度最低，與生化指標測定結果一致。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟HE染色病理切片(10×20)

A.空白組;B.模型組;C.陽性對照組;D.紅芪復方一組;E.紅芪復方二組；F.紅芪復方三組；G.紅芪復方四組。

Fig.1 HE staining pathological sections of liver of mice in each group (10×20)

A.normal control group;B.model group;C.positive control group；D.the traditional Chinese medicine prescription 1 ofRadixHedysarigroup；E.the traditional Chinese medicine prescription-2 ofRadixHedysarigroup；F.the traditional Chinese medicine prescription-3 ofRadixHedysarigroup；G.the traditional Chinese medicine prescription-4 ofRadixHedysarigroup.

4 討論

肝損傷是指在理化因素作用下，肝細胞發生腫脹、變性、壞死和凋亡等不同程度的病變，是多種肝臟疾病共有的病理狀態[4-5]。本研究采用的CCl4致化學性肝損傷小鼠模型是目前使用最為廣泛的肝損傷動物模型[6-8]。

研究證實，CCl4誘導肝損傷的機制是CCl4被肝微粒體細胞色素P450 代謝活化，產生·CCl3、CCl3OO·等一系列自由基[9]，過量的自由基進而引起肝微粒體細胞膜的脂質過氧化，使肝細胞膜結構和功能的完整性遭到破壞，從而導致肝細胞損傷、壞死[10-11]。當肝細胞發生損傷時，細胞膜結構被破壞，膜通透性改變，使可溶性酶ALT和AST由細胞內滲漏進入血循環，引起血清中ALT和AST水平升高[12]。由此可見，ALT和AST的含量變化能在一定程度上反映肝細胞的受損程度[13]。SOD是清除體內自由基、抑制自由基反應的重要物質基礎[14]，其活性降低會導致體內氧自由基增多，從而使細胞膜結構與功能受到損傷。SOD在體內的氧化與抗氧化平衡中至關重要，可對損傷起到一定的緩解作用。而MDA 是脂質過氧化的產物，可與體內的生物大分子結合，破壞細胞膜的結構和功能，最終導致細胞腫脹、壞死。因此，SOD 活性和MDA 含量可反映體內脂質過氧化程度，間接反映體內組織和細胞損傷程度[15-17]。

研究結果顯示，肝損傷小鼠血清ALT和AST含量明顯升高，反映CCl4誘導肝損傷小鼠的肝功能受損；而肝組織勻漿SOD 活性降低，MDA含量增高則反映脂質過氧化程度增強；HE染色的肝組織切片可較直觀地反映肝組織病理損傷的程度，與模型組比較，陽性對照組和各紅芪復方給藥組肝組織壞死區域變小，細胞腫脹、變性等病理性損傷均有不同程度的減輕。

紅芪性甘，微溫，歸肺、脾經，具有補氣升陽、固表止汗、生津養血和行滯通痹等功效[18]。丹參、郁金、當歸和莪術歸肝經，具有養血調肝、調達肝氣及活血祛瘀的功效。茵陳、板藍根和柴胡能消熱利濕、利膽退黃。五味子和女貞子為扶益補虛之品，能補益肝腎。紅芪復方各組均可明顯降低CCl4誘導的化學性肝損傷小鼠血清ALT和AST水平，增強肝組織SOD活性，降低MDA含量，同時還可明顯減輕肝組織病變損傷程度。紅芪復方三(紅芪、茵陳、丹參、女貞子和莪術)效果最佳，具有進一步研究價值。