pH/酶雙重敏感腫瘤靶向遞藥體系的合成及應用

王丁丁，南 軍，孫中洋，郭松巖，徐若男

(1.中國人民解放軍第73852部隊藥品器材供應站，南京 210003；2.江蘇省軍區保障局，南京 210024；3.中國人民解放軍第四五四醫院骨科，南京 210002；4.中國人民解放軍第九二零醫院藥劑科，昆明 650000；5.南京軍區總醫院保健辦公室，南京 210000)

化療是目前臨床上治療癌癥的重要手段之一，但由于靶向性差、半衰期短、系統毒性大和靶部位累積差等問題而受到制約[1-5]。聚合物納米藥物是穩定的“載體-藥物”結構，可通過腫瘤區域特有的高通透性和滯留效應(enhanced permeability and retention effect，EPR)被動靶向至腫瘤組織或細胞，提高藥物在靶部位的累積，降低不良反應[6-10]。但藥物與聚合物載體結合后，在靶部位釋放藥物緩慢、釋放率不穩定等問題丞待解決。

研究者通過設計出具有“刺激-響應”功能的聚合物藥物用于克服上述缺點[11-12]。刺激響應型聚合物藥物是指藥物通過可斷裂化學鍵與聚合物相連，利用內源性[13-15]或外源性[16-19]刺激使藥物在靶部位可控釋放，實現提高藥物釋放率、迅速釋藥等目的。順式烏頭酸酐與伯胺反應后形成順式烏頭酸鍵[20]。順式烏頭酸鍵中C-4位置上的羧基pH值在5.0～5.5可催化臨近位置上C-1羧基形成的酰胺鍵發生水解，因此被用于藥物胞內晚期內涵體和溶酶體釋放的研究。

本研究利用順式烏頭酸酐(CAA)修飾阿霉素(DOX)后得到具有酸敏功能的CA-DOX (CAD)，與親水性較強的4-arm PEG-COOH相連得到4-arm PEG-CAD并進一步制得具有酸敏感功能的納米粒。文獻報道細胞穿膜肽(transcriptional activator protein，TAT)中第4個賴氨酸在TAT發揮穿膜作用過程中發揮重要作用[21]，利用基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)敏感多肽GPLGIAGQ[15,22]修飾第4個賴氨酸可有效降低TAT的穿膜效率，使其獲得特異性。因此，本研究利用GPLGIAGQ修飾后的TAT連接至納米粒上，在正常環境中TAT不發揮穿膜作用；到達腫瘤區域后，在腫瘤微環境MMP2酶作用下使多肽斷裂，裸露TAT發揮穿膜作用。此外，研究順式烏頭酸鍵的斷裂效率，并對其理化性質和體外抗腫瘤效率進行研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 真空干燥箱(大連第四儀器廠)；JIKA磁力攪拌器(德國IKA公司)；EM-2000EX型透射電鏡(日本Hitachi公司)；激光粒度分析儀(英國Malven公司)；AVance DMX500核磁共振(Bruker公司)；ZYJ-L超凈細胞工作臺(張家口空氣凈化工程公司)；二氧化碳培養孵箱(美國Heareus公司)；激光共聚焦顯微鏡(美國奧林巴斯公司)；紫外分光光度計、高效液相色譜儀[安捷倫科技(中國)有限公司]。

1.2試藥 阿霉素(DOX)、順式烏頭酸酐(CAA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和氘代二甲基亞砜(d-DMSO)，均購自阿拉丁公司；MMP2敏感多肽連接TAT(GPLGIAGQ-TAT)購自上海昶晰生物有限公司；4-arm PEG購自西安瑞禧生物有限公司；細胞培養瓶、細胞培養液、96孔板、激光共聚焦培養皿、血清、胰蛋白酶、青鏈霉素、MTT試劑、細胞核染料DAPI等均購自西安科昊生物有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、1-4-二氧六環、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸、十二烷基硫酸鈉、乙腈、甲醇等均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法

2.1CAD的合成 取一定量的CAA溶于1,4-二氧六環中，同時稱取DOX·HCl溶于碳酸氫鈉溶液(0.4 mol·L-1)，混合，將pH值調節至8.5，冰浴反應2 h，室溫反應2 h。將pH值調節至4.5后出現大量沉淀，以12 000 r·min-1離心，棄去上清液，收集產物后真空干燥12 h后得到CAD。見圖1。

圖1 CAD的合成

Fig.1 Synthesis of CAD

2.2GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD的合成及納米粒GTPC的制備 合成過程見圖2。取CAD溶于DMSO中，加入EDC和NHS室溫反應12 h活化羧基后加入4-arm PEG(nCAD∶nPEG=3∶1)，得到PEG-CAD，稱取與PEG等摩爾比的GPLGIAGQ-TAT，加入反應液，室溫反應12 h后凍干得到GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD。將GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD溶于DMSO配制成質量濃度為1.5 mg·mL-1的溶液，攪拌15 min后將溶液加入截留相對分子質量為3.4 kDa的透析袋中，在去離子水中室溫透析48 h。透析結束后冷凍干燥得到淺紅色固體，即為納米粒GTPC。

2.3納米粒的粒徑測定 利用馬爾文粒度分析儀對納米粒的粒徑進行測定；通過透射電鏡觀察納米粒的形貌。將納米粒溶于DMSO中配制成質量濃度為1 mg·mL-1的溶液，超聲分散2次，每次15 s，取20 μL滴于銅網上，室溫風干后置于透射電鏡下觀察其形態。

2.4納米粒的載藥率測定 標準曲線繪制：將DOX溶于蒸餾水中，配制成一定質量濃度的溶液，取6組DOX溶液并稀釋成質量濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.5，0.8和1.0 μg·mL-1的溶液，于λ=488 nm處測定吸光度值A，繪制標準曲線。

精密稱取10 mg GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD，溶于2 mol·L-1的鹽酸溶液中，加熱攪拌1 h使DOX充分斷裂后調節pH值至中性，利用紫外分光光度計測定DOX的含量，并利用公式測定載藥率。

聚合物中DOX的載藥率=聚合物中DOX的質量÷聚合物的質量×100%

圖2 GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD的合成及納米粒GTPC的制備

Fig.2 Synthesis of GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD and the self-assembly of the nanoparticles GTPC

2.5CAD酸敏特性測定 通過HPLC法測定CAD中順式烏頭酸鍵的斷裂效率來測定CAD的酸敏特性。稱取5 mg CAD固體，溶于pH值為 5.0和7.4的PBS-檸檬酸緩沖液中，以120 r·min-1在37 ℃恒溫振蕩器中避光孵育，分別于0，4和8 h取樣，按照以下色譜條件進行HPLC分析：色譜柱：Agilent 1260高效液相色譜儀；Diamonsil C18柱；流動相：十二烷基硫酸鈉溶液-乙腈-甲醇(比例為47∶47∶6)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；進樣體積：10 μL。

2.6納米粒的模擬釋藥實驗 納米粒的釋藥研究是利用動態透析法進行測定。模擬胞內溶酶體環境(pH 5.5)、腫瘤細胞外微環境(pH 6.5)和正常組織環境(pH 7.4)測定納米粒的藥物釋放含量。稱取6 mg 納米粒溶于3 mL對應pH值的PBS緩沖液中，以100 mL對應pH值的緩沖液為外液，置于恒溫搖床中(120 r·min-1)模擬體內溫度(37 ℃)，于相應時間點取出透析外液1 mL，并加入等量相同pH值的PBS緩沖液。實驗結束后通過紫外分光光度計測量所取溶液中DOX的含量，得到藥物釋放曲線。

2.7GTPC的體外細胞毒性研究 膠束的體外毒性研究利用MTT試驗進行評估。MDA-MB-231細胞作為受試細胞，區分有酶(質量濃度為100 μg·mL-1)和無酶情況，合成GTPD(不具備酸敏特異性釋藥的納米粒)作為對照組。

消化對數生長期的細胞至15 mL離心管中，調節細胞濃度為2×104個·mL-1，向96孔板中每孔加入150 μL，培養24 h使細胞貼壁。移除培養液并加入不同質量濃度的納米粒，每組設定6個復孔并設空白對照組，培養48 h后，向復孔中加入MTT溶液，用搖床低速振蕩10 min，置于孵箱中孵育4 h后加入DMSO溶解，通過酶標儀測定復孔的吸光度值A。利用空白對照組的吸光度值比對計算細胞存活率。

利用細胞毒研究評價不含藥物載體的細胞毒性。消化對數生長期的細胞至離心管中，離心后加入新鮮培養液并調節細胞濃度為2×104個·mL-1，向96孔板中每孔加入150 μL，培養24 h使細胞貼壁。移除培養液并加入質量濃度分別為200，400，600，800和1 000 μg·mL-1的GPLGIAGQ-TAT-PEG，每組設定6個復孔并設空白對照組，培養48 h后，向復孔中加入MTT溶液，通過搖床低速振蕩10 min，置于孵箱中孵育4 h后加入DMSO溶解，用酶標儀測定復孔的吸光度值。利用空白對照組的吸光度值比對計算細胞存活率。

2.8GTPC的細胞內攝研究 消化培養瓶中的MDA-MB-231細胞，加入新培養液后配制成濃度為1.0×105·mL-1的細胞懸液，并向每個激光共聚焦培養皿中加入700 μL，待細胞爬滿40%后移除培養液，調節含有MMP2的GTPC、TPC的培養液質量濃度和不含MMP2的GTPC、TPC培養液質量濃度并加至培養皿中，培養4 h，移除培養液，用PBS緩沖液沖洗2次，用質量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定8 min，向培養皿中加入質量濃度為5 μg·mL-1的DAPI染色液避光染色5 min，用PBS緩沖液沖洗2次，4 ℃避光保存。利用CLSM觀察DOX的入胞情況。DOX顯紅色，DAPI鏡下顯藍色熒光，HeLa細胞轉染的GFP蛋白顯示為綠光。

3 結果

3.1納米粒的制備 納米粒的載藥率為22.6%，核磁共振氫譜表征GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD，表明其成功制備，其中1.0,1.2,2.9和3.9 ppm為TAT的特征峰，3.5 ppm為PEG的特征峰，7.0～8.0 ppm為DOX的特征峰，由于順式烏頭酸鍵含量相對其他組分較低，因此在核磁圖譜上未出現明顯特征峰。見圖3。

圖3 GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD的核磁共振氫譜(溶劑：DMSO)

注：a.PEG;b.TAT;c.GPLGIAGQ;d.DOX。

Fig.31H-NMR spectra of GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD (solvent:DMSO)

Note：a.PEG;b.TAT;c.GPLGIAGQ;d.DOX.

3.2納米粒的粒徑形貌表征 通過粒度分析儀測得納米粒水合粒徑為132.1 nm；透射電鏡可以看出GTPC的粒徑約為 90 nm。見圖4。

3.3CAD的酸敏特性 為了驗證CAD的釋放產物，選用pH值為5.5和pH值為7.4來模擬腫瘤細胞內晚期內涵體及溶酶體酸環境和正常組織pH環境，通過HPLC法測定CAD斷裂后DOX的質量濃度。游離DOX的特征峰在pH值為5.5時逐漸變高，說明CAD在酸性pH值條件下水解速度明顯提高，1 h內就有35.3%被水解從而釋放出DOX，6 h時釋放出85.2%，作為對比，在pH值為7.4時，24 h釋放的DOX低于15%，表明CAD能夠迅速響應內涵體/溶酶體酸性環境，使膠束中的DOX在進入細胞之前保證相對穩定的狀態，降低了DOX在體循環過程中泄露的風險，從而降低了DOX的不良反應，提高了藥物的利用率及使用效率。見圖5。

圖4 納米粒GTPC的粒徑(A)及形態(B)

Fig.4 Particle size (A) and morphology (B) of nanoparticles GTPC

圖5 CAD在不同pH值情況下水解的HPLC圖譜

A.pH 7.4；B.pH 5.5。

Fig.5 The HPLC chromatograms of CAD hydrolysis in different pH

A.pH 7.4；B.pH 5.5.

3.4納米粒的藥物釋放研究 選用胞內溶酶體環境(pH 5.5)、腫瘤細胞外微環境(pH 6.5)和正常組織環境(pH 7.4)對藥物的體外模擬釋放進行測定。模擬釋藥曲線見圖6。隨著pH值的降低，GTPC的藥物釋放有明顯差異。pH值為6.5和7.4時藥物累積釋放量低于20%，pH值為5.5時累積釋放率明顯提高，達到88%。這是由于順式烏頭酸鍵pH值在5.0～5.5時可快速斷裂，釋放DOX。結合CAD斷裂研究，說明在GTPC體內長循環過程中保持穩定，入胞后在腫瘤微環境MMP2作用下脫去特異性多肽，裸露TAT并實現納米粒高效入胞，在溶酶體/內涵體酸性環境下特異性釋放藥物，提高藥物利用率。

圖6 GPTC在不同pH值條件下的藥物釋放情況

Fig.6 Drug release of GTPC at different pH conditions

3.5細胞毒性研究 體外細胞毒研究選用MDA-MB-231細胞作為受試細胞。實驗分為有酶和無酶組，給藥GTPC和TPC后共培養48 h后測得結果見圖7，GTPC的IC50為1.77 μg·mL-1。這是由于GTPC到達腫瘤區域后，在MMP2作用下使TAT實現去屏蔽性能，發揮高效穿膜作用攜帶納米粒入胞，入胞后，隨著pH值的降低，酸敏順烏頭酸鍵實現特異性斷裂，促進DOX的釋放進而發揮藥效，IC50值與游離DOX的IC50值(1.52 μg·mL-1)無顯著性差異，說明該體系可有效遞送DOX入胞并發揮作用。作為對比，未加MMP2的GTPC組的IC50值較高，由于多肽無法被裂解，TAT的穿膜能力被抑制，藥物從載體斷裂的效率較低，發揮抗腫瘤作用較差。

圖7 納米粒GTPC與MDA-MB-231細胞培養48 h的細胞存活率

A.有酶；B.無酶。

Fig.7 Cell viability of GTPC and MDA-MB-231 cells cultured for 48 h

A.with enzymes;B.without enzymes.

3.6細胞內攝研究 通過激光共聚焦顯微鏡觀察4組納米粒在MDA-MB-231細胞內的熒光強度，觀察給藥4 h后細胞對4組納米粒的內攝情況，結果見圖8。由圖8可知，在含有MMP2酶的培養液中，GTPC和TPC在給藥4 h后可在MDA-MB-231細胞內觀察到明顯的DOX的熒光，這是由于短時間內GTPC進入到細胞后在酸性條件下順烏頭酸鍵斷裂釋放DOX入核。作為對比，在未加入MMP2的實驗組中，DOX熒光較弱，這是由于連接在TAT第4個賴氨酸上的多肽并未被解離，TAT穿膜效率被大大降低，未能提高GTPC的入胞效率，DOX無法發揮作用。此外，TPC在無MMP2的情況下，MDA-MB-231細胞中也可觀察到DOX熒光，這是由于TAT未被屏蔽，可有效攜帶DOX入胞。

通過本研究表明，細胞毒性實驗中GTPC的細胞毒性最強，這是由于納米粒入胞后充分地發揮了連接DOX的酸敏鍵的特性，使DOX實現高效的胞內釋藥，有效提高化療藥物的生物利用率，此外，在酶敏多肽的保護下，TAT在正常組織和體循環過程中的穿膜效率被有效降低，到達靶部位后，在腫瘤微環境特異性酶MMP2作用下迅速切斷多肽鏈，實現TAT的屏蔽/去屏蔽功能，提高了該遞藥體系的安全性。

圖8 MDA-MB-231細胞對納米粒的細胞內攝情況(DAPI為細胞核染料)

Fig.8 Confocal microscopic images of cellular internalization of the nanoparticles by MDA-MB-231 cells(DAPI was used to stain the cell nucleus)

4 結論

聚合物納米藥物載體通過負載抗腫瘤藥物后形成200 nm以下的納米粒，進而通過體內長循環被動靶向至腫瘤區域，利用腫瘤區域或胞內與正常組織pH值、酶差異或外源性刺激特異性釋藥，可實現增強藥效、降低毒性和不良反應等目的，成為近年來的研究熱點。

本文通過化學合成的方法利用順式烏頭酸酐修飾DOX制備出具有酸敏感順式烏頭酸鍵的CA-DOX，與4-arm PEG相連后自組裝形成pH敏感納米粒，TAT作為提高穿膜效率的功能基團引入納米粒，提高納米粒GTPC的入胞能力，通過MMP2敏感多肽修飾TAT發揮功能的氨基酸，實現TAT的選擇特異性。粒度分析儀測定水合粒徑為132.1 nm，TEM觀察到粒徑為90 nm；對pH敏感順式烏頭酸鍵的斷裂效率展開重點研究，首先利用HPLC法測定CAD中DOX的斷裂效率，通過結論可知，pH值在5.5時4 h內斷裂90%以上，進一步通過釋藥研究可知，納米粒中DOX在pH值為5.5時釋藥超過85%，而pH值為7.4時釋藥不足20%。由體外細胞毒實驗可知，具有酶敏特性的GTPC在有MMP2的情況下細胞毒接近未屏蔽TAT功能位點的TPC，而在無MMP2的情況下細胞毒性較弱，說明MMP2敏感多肽可有效抑制TAT在正常環境下的穿膜效率；與不具備酸敏特性的納米粒GTPD比較，GTPC的細胞毒明顯提高，這是由于在胞內溶酶體酸性條件下可以提高藥物釋放效率，使藥物更高效地作用于細胞核，進而殺死細胞。此外，載體4-arm PEG可有效解決普通PEG可修飾端基少的缺點，提高載藥率，有利于腫瘤的治療。

本研究通過使用pH敏感順式烏頭酸鍵將藥物和聚合物載體連接制備納米粒，引入具有酶敏感功能的TAT提高納米粒的穿膜效率，構建pH/酶雙重敏感納米釋藥體系，提高納米粒在體內長循環穩定性和安全性，實現DOX靶向殺傷腫瘤細胞的功能，并通過化學鍵連接藥物防止其在正常環境下泄漏，有利于提升抗腫瘤藥物的安全性，為治療腫瘤提供新的思路。