淫羊藿苷在大鼠胃腸道內容物中的降解動力學研究

王 勤，丁雨寅，陶俊燁，宋征宇，吳正紅，丁選勝*

(1.中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學學院，南京 211198；2.中國藥科大學藥學院，南京 211198)

淫羊藿苷(icariin，ICA)是小檗科淫羊藿屬植物的主要有效成分[1]，具有抗動脈粥樣硬化、影響生殖功能、促進成骨細胞分化、抗腫瘤及抗病毒等作用[2-3]。ICA難溶于水[4]，在大鼠體內藥動學研究表明口服生物利用度較低[5-6]，極大地限制了ICA的開發應用。本實驗采用大鼠胃腸道內容物勻漿液體外實驗法，研究其在胃和小腸各腸段的穩定性，并推導其降解動力學方程，以期為ICA的制劑開發利用和藥理作用機制研究提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 SPD20-A高效液相色譜儀(日本島津公司，包括LC-20AT溶劑輸送泵、UV-VIS檢測器、Rheodyne 7725i手動進樣閥和LC Solution工作站)；RPL-D2000柱溫箱(大連日普利科技儀器有限公司)；PHS-3C雷磁pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；MicroCL 21R超速冷凍離心機，Multiskan FC酶標儀，902型超低溫冰箱(Thermo公司)；BT125D電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；HH-S型恒溫水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)。

1.2試藥 淫羊藿苷(批號JT171010，質量分數>98%，陜西錦泰生物工程有限公司)；淫羊藿苷對照品(批號110737-201516，質量分數為94.2%，中國食品藥品檢定研究院)；鹽酸(質量分數為36.0%～38.0%，分析純，南京化學試劑股份有限公司)；氫氧化鈉(分析純，西隴化工股份有限公司)；甲醇和乙腈(色譜純，均為上海星可高純溶劑有限公司)；磷酸二氫鈉(分析純，南京化學試劑一廠)；磷酸氫二鈉(分析純，江蘇永華精細化學品有限公司)。

1.3實驗動物 8只SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量為180～200 g，雌雄各半，由南京市江寧區青龍山動物繁殖廠提供，生產許可證號為SCXK(浙)2014-0001。分籠飼養，自由飲水，喂食標準顆粒飼料，室溫控制在24±2 ℃，相對濕度為40%～70%。

2 方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1ICA對照品儲備液 精密稱取ICA對照品20 mg，置于燒杯中，先用少量甲醇溶解，再移入100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得質量濃度為0.2 mg·mL-1的ICA對照品儲備液。

2.1.2ICA供試品儲備液 精密稱取ICA樣品20 mg，置于燒杯中，先用少量甲醇溶解，再移入10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得質量濃度為2 mg·mL-1的供試品儲備液。

2.1.3大鼠胃腸道內容物勻漿液的制備 取SD大鼠8只，雌雄各半，禁食不禁水24 h，斷頸椎處死后立即打開腹腔，冰上操作，其中4只用適量預冷的pH值為1.5的鹽酸溶液及pH值為4.5，6.5，6.8和8.0的磷酸鹽緩沖液沖洗胃、十二指腸、空腸、回腸和結腸，收集其內容物，其余4只用預冷的生理鹽水收集全胃腸道內容物。內容物在4 ℃以5 000 r·min-1冷凍離心20 min，取上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量，分別用相應的緩沖液調節蛋白質質量濃度至同一水平。

2.2色譜條件 色譜柱：Hedera ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶水=3.4∶6.6；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

2.3方法學建立及考察

2.3.1專屬性考察 對大鼠胃和各腸段內容物勻漿液中待測成分的色譜專屬性進行分析，記錄圖譜，結果見圖1。由圖1可知，ICA峰形良好，各溶劑不產生干擾，專屬性良好。

圖1 不同內容物中ICA的HPLC圖

a.流動相；b.對照品；c.胃內容物；d.十二指腸內容物；e.空腸內容物；f.回腸內容物；g.結腸內容物；1.ICA。

Fig.1 Chromatograms of ICA in different contents

a.mobile phase;b.control substance;c.gastric content;d.duodenal content;e.jejunal content;f.ileac content;g.colonic content; 1.ICA.

2.3.2標準曲線 精密量取2.1.1項下制備的ICA對照品儲備液0.25 mL，置于20 mL量瓶中，加流動相定容至刻度，得質量濃度為2.5 μg·mL-1的ICA對照品溶液；精密吸取5 mL上述ICA對照品溶液，置于10 mL量瓶中，加流動相定容至刻度，得質量濃度為1.25 μg·mL-1的ICA對照品溶液；分別精密量取2.1.1項下制備的ICA對照品儲備液0.25，0.50，1.00 和2.00 mL，置于10 mL量瓶中，加流動相稀釋并定容至刻度，搖勻，得質量濃度分別為5，10，20 和40 μg·mL-1的ICA對照品溶液，用有機系濾頭過濾后，取中間段濾液，分別進樣20 μL，每個質量濃度進樣3次，記錄峰面積。以ICA質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)，進行線性回歸，得回歸方程：y=55 080x+19 380，r=0.999 7，結果表明，ICA質量濃度在1.25～40 μg·mL-1范圍內峰面積與質量濃度線性關系良好。

2.3.3精密度考察 精密吸取同一質量濃度的對照品溶液，按照2.2項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，計算得峰面積的RSD值為0.58%，表明精密度符合定量測定的要求。

2.3.4回收率實驗 分別精密吸取2.1.1項下制備的ICA對照品儲備液4，5和6 mL，置于3個10 mL量瓶中，用流動相定容至刻度，配制成質量濃度分別為80，100 和120 μg·mL-1的溶液，分別按照2.2項下色譜條件進樣，測定峰面積，各質量濃度進樣3次，按照外標法計算得ICA平均回收率為97.53%(n=9，RSD平均值為0.19%)，表明該方法回收率良好。

2.3.5最低檢測限 吸取2.3.2項下配制的最低質量濃度的ICA對照品儲備液，用流動相逐步稀釋，分別進樣，記錄色譜圖，以ICA峰高接近基線噪音3倍時的進樣質量濃度為最低檢測限。結果測得最低檢測限為1.25 μg·mL-1。

2.3.6穩定性與降解動力學考察 精密稱取ICA原料藥20 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，精密量取0.25 mL，8份，分別置于8個25 mL量瓶中，分別加入以下8組介質定容：①大鼠胃內容物；②十二指腸內容物；③空腸內容物；④回腸內容物；⑤結腸內容物；⑥10 μg·mL-1全胃腸道內容物；⑦20 μg·mL-1全胃腸道內容物；⑧40 μg·mL-1全胃腸道內容物，搖勻，用2 mL離心管分裝，封口膜密封，于37 ℃恒溫振搖0.00，0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，8.00，12.00和24.00 h， 以10 000 r·min-1離心5 min，取上清液，立即冷卻終止反應，0.45 μm水系濾膜過濾，取中間續濾液，進樣20 μL，超出線性范圍的樣品用甲醇適當稀釋后進樣，記錄峰面積，計算ICA平均剩余百分率，見表1和表2。以平均剩余百分率為縱坐標、時間為橫坐標繪制平均剩余百分率隨時間變化的曲線，見圖2和圖3。考察ICA在8種介質中的穩定性；按反應動力學方法計算反應級數、表觀降解速率常數(KA)、半衰期(t0.5)和有效期(t0.9)，考察ICA在8種介質中的降解動力學特征，見表3和表4。

表1 ICA在不同胃腸道內容物中的剩余率

Tab.1 Residual rates of ICA in different gastrointestinal contents

t/h不同胃腸道內容物中剩余率/%胃十二指腸空腸回腸結腸0.00100.00100.00100.00100.00100.000.2571.6393.0156.7054.0599.370.5066.1679.0839.4740.6898.251.0063.9267.7935.0324.8897.602.0061.3053.9126.2410.6396.793.0058.4244.2323.884.4995.424.0056.2139.6119.932.5895.245.0054.4834.1115.61- 94.438.0049.8025.1411.45- 90.5112.0048.8619.027.91- 90.3424.0047.098.481.96- 82.04

注：-表示未檢測到。

表2 ICA在不同質量濃度全胃腸道內容物中的剩余率

Tab.2 Residual rates of ICA in different concentrations of total gastrointestinal contents

t/h不同質量濃度(μg·mL-1)內容物中剩余率/%1020400.0100.00100.00100.000.580.8671.7866.001.065.2348.4740.412.047.0926.0918.473.037.2614.516.944.027.336.872.595.022.353.67- 6.017.481.73- 8.011.27- -

注：-表示未檢測到。

圖2 ICA在不同胃腸道內容物中時間-剩余含量曲線

注：C0表示ICA在不同胃腸道內容物中的初始質量濃度，Ct表示ICA在不同胃腸道內容物中不同時間的質量濃度。

Fig.2 Time-residual rate curves of ICA in different gastrointestinal contents

Note:C0is the initial mass concentration of ICA in different intestinal contents,Ctis the mass concentration of ICA in intestinal contents at different times.

圖3 ICA在不同質量濃度全胃腸道內容物中時間-剩余含量曲線

Fig.3 Time-residual rate curves of ICA in different concentrations of total gastrointestinal contents

表3 ICA在不同內容物中的降解動力學方程

Tab.3 Degradation kinetic equation of ICA in different contents

注：1～8分別代表胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、低質量濃度全胃腸道、中質量濃度全胃腸道、高質量濃度全胃腸道內容物。

表4 ICA在不同內容物中的降解參數

Tab.4 Degradation parameters of ICA in different contents

降解介質KAt0.9/ht0.5/h相關系數降解反應級數胃0.037 52.8118.480.981 9一級十二指腸0.018 30.312.810.996 3二級空腸0.021 00.141.260.991 2二級回腸0.835 30.130.830.992 9一級結腸0.007 913.3487.720.986 5一級低質量濃度全胃腸道0.051 60.111.010.992 4二級中質量濃度全胃腸道0.667 40.161.040.999 0一級高質量濃度全胃腸道0.909 10.120.760.997 3一級

3 討論

藥物在胃腸道環境下的穩定性是藥物開發過程中必要的研究環節，特別是口服藥物在胃腸道的穩定性將會直接影響藥物在胃腸道的吸收。文獻報道，大鼠腸道分離出的腸道菌群將ICA迅速代謝成淫羊藿次苷Ⅱ[7]，且ICA在不同腸段的表觀滲透系數有顯著差異[8]。

由于食物在胃、小腸(十二指腸、空腸和回腸)、大腸(盲腸、結腸)的停留時間分別為4～6，6～8和18～24 h[9]，故本研究取樣時間點選擇0～24 h，最大程度地模擬ICA在胃腸道的停留情況。從實驗結果來看，ICA在胃液(37 ℃，pH值1.5)中較穩定，與文獻報道一致[7]。研究表明，ICA進入腸道后被迅速水解[10]，在大鼠各腸段代謝成淫羊藿次苷后被吸收[8，10]。根據文獻[11]可知，以質量濃度C對時間t作圖，若C-t作圖為直線則為零級反應，ln(C/C0)-t作圖為直線則為一級反應，1/C-t作圖為直線則為二級反應，1/C2-t作圖為直線則為三級反應。本實驗結果顯示，ICA在不同腸段內容物中的穩定性有顯著差異，其中結腸對ICA的代謝作用較弱，24 h內僅降解18%；但易被小腸中的內容物降解，其中十二指腸和空腸為二級降解反應，半衰期分別為2.81和1.26 h，說明降解速度與內容物質量濃度相關；回腸為一級降解反應，其降解速度最快，半衰期為0.83 h，4 h內降解率高達97.5%。據文獻報道，大鼠腸黏膜上的乳糖酶根皮苷水解酶(LPH酶)[12-13]和腸道菌群對ICA具有分解作用[11,14]。不同腸段內容物對ICA的降解速率不同可能是由于不同腸段酶的種類與質量濃度以及腸道酸堿性不同導致的[15]。而ICA主要在小腸被降解吸收(大腸和胃由于吸收面積有限，不是藥物吸收的主要部位)，繼而在體內發揮藥效。因此，可考慮設計十二指腸定位釋藥系統，提高ICA在小腸的分布以及提高活性降解產物的吸收效率。ICA在不同質量濃度的全胃腸道內容物中降解速率有顯著差異，低濃度為二級降解反應，中濃度和高濃度為一級降解反應。

ICA口服生物利用度低的原因可能是其在小腸極易被降解[11]，其在Caco-2細胞中表觀滲透系數較小[16]，或存在P糖蛋白和鈉離子依賴型外排系統[17-19]，本實驗結果可為ICA口服劑型的設計提供參考。文獻報道ICA在體內主要降解產物為淫羊藿次苷[20-21]，ICA降解產物在腸道的吸收及其在體內的代謝機制還需進一步研究。