猴T淋巴細胞趨向性病毒l型RPA和熒光RPA檢測方法的建立*

熊 煒 林穎崢 魏曉鋒 陳鴻軍 張 強 王 艷 李 健

(1. 上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135)(2. 上海實驗動物研究中心，上海 201203)(3．中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241)

猴T淋巴細胞趨向性病毒(Simian T-cell 1ymphotropic virus，STLV)為逆轉錄病毒，其基因組為單鏈RNA，它與人T淋巴細胞趨向性病毒(Human T- cell lymphotropic virus，HTLV)同屬于靈長類嗜T淋巴細胞病毒，是進出境實驗用猴篩查的重要病原之一[1-2]。1982年STLV首次在日本獼猴體內發現，之后在亞洲和非洲超過30種非人靈長類動物中發現了STLV；根據核酸序列和血清學特性，STLV可分為三個亞型，即STLV-1、STLV-2、STLV-3，其中亞洲非人靈長類動物主要感染STLV-1[3-4]。STLV-l主要侵害猴的免疫系統，與惡性淋巴瘤、淋巴組織增生等疾病密切相關；通常獼猴感染STLV-l后，可較長時間不呈現明顯臨床癥狀，期間它作為攜帶者可將病毒傳給其它易感猴，對猴的健康造成影響，干擾實驗結果[5]。目前報道的STLV-1的檢測方法主要有免疫熒光、中和試驗、蛋白印跡和ELISA等血清學方法，RT-PCR是STLV-1最常用的核酸檢測方法[6-8]。重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是一種新型的，可以替代PCR的核酸檢測技術，它能夠在20 min內進行常溫下的單分子核酸檢測[9-10]。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合野外及檢疫現場使用。為了提高口岸對進出境野生及實驗用靈長類動物STLV-1感染情況的監測和流行病學調查，本研究建立了RPA和熒光RPA檢測STLV-1的方法，并對方法的特異性、敏感性和穩定性進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TRIzol購自Invitrogen公司，Taq酶、AMV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、隨機引物、DNA Marker(DL2000)購自Takara公司；RPA檢測試劑購至英國TwistDx Inc公司。

1.2 病毒樣品來源及處理

STLV-1陽性組織和血清樣為本室保存。陽性組織樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3 000 g離心15 min，收集上清液待檢。本研究使用的其他病毒和細菌核酸，如猴D型逆轉錄病毒(Simian type-D retrovirus，SRV)、猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus，SIV)、猴B病毒(Simian B virus，BV)、沙門氏菌、志賀氏菌樣本，由本室保存。

1.3 RNA抽提及cDNA模板制備

取100 μL待檢上清液或血清，加1 mL TRIzol試劑，吹打20次，加入200 μL氯仿，渦旋震蕩30 s混勻；12 000 r/min離心15 min；取上層水相，加500 μL異丙醇，顛倒混勻，-20 ℃放置20 min；12 000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀用1 mL DEPC水配制的75%乙醇清洗；7 500 r/min離心10 min；棄上清，沉淀室溫干燥10 min；加30 μL DEPC水溶解RNA沉淀。取11 μL RNA溶液，加5倍逆轉錄酶濃縮緩沖液4 μL、dNTP 1 μL、隨機引物1 μL、RNA酶抑制劑1 μL、AMV逆轉錄酶2 μL，置PCR儀上42 ℃反應60 min，即得cDNA模板。

1.4 RT-PCR檢測

引物針對STLV-1的gag蛋白基因(gag polyprotein)設計，擴增基因片段大小為348 bp，其上游引物為：5‘ GCT CAT CAC TGG CTT AAC TTC CTC C 3’，下游引物為：5‘ ATG TGG ATG CAT GAC TGG AAG GAC 3’。在PCR薄壁管中，加cDNA模板2 μL、10倍Taq酶濃縮緩沖液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq酶0.25 μL，加水補足總體積至25 μL。將PCR管置PCR儀上，按如下程序擴增：首先94 ℃ 3 min；然后94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環；最后72 ℃ 3 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統拍攝。

1.5 RPA引物和探針

使用Vector NTI Suite軟件分析不同國家和地區分離的STLV-1的gag蛋白(gag polyprotein)基因的保守序列，用Primer Express軟件設計RPA引物和探針。RPA正向引物(RPA-STLV1F)序列為5‘ ACA CCG GCT TGG ATC TGT CCC ATT AAC TAC TC 3’， 反向引物(RPA-STLV1R)序列為5‘ CCA TGT GGA TGC ATG ACT GGA AGG ACT TGA GG 3’。 熒光RPA檢測的上游引物(RPAY-STLV1F)序列為：5‘ TGC CAA AGA CCT CCA AGA CCT CCT ACA GTA CC 3’，下游引物(RPAY-STLV1R)序列為：5‘ GAC CGG CTA AGG GGT TAT AAC CTG TAA TAC CTC 3’， RPA探針(RPAY-STLV1P)序列為：5’ CTC CCT CCA TCA CCA GCA GCT AGA TAG CCT TA(FAM-dt)(THF)(BHQ1-dt)AGA GGC CGA A-C3 3’。引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。

1.6 RPA檢測

采用GENIE Ⅱ恒溫擴增PCR儀。反應體系為：25 μL 2倍反應緩沖液、8.2 μL dNTP、5 μL 10倍基酶混合物、上下游引物(RPA-STLV1F、RPA-STLV1R)各2.4 μL；混勻后，再加入2.5 μL 20倍核心反應液、1 μL 50倍RT反應液；混勻后，最后加入2.5μL 280 mmol/L醋酸鎂、1 μL待檢核酸溶液。反應條件為：39 ℃孵育20 min。反應結束后，凝膠電泳分析擴增產物，結果判定。

1.7 熒光RPA檢測

采用GENIE Ⅱ恒溫擴增PCR儀。反應體系為：25 μL 2倍反應緩沖液、7.2 μL dNTP、5 μL 10倍探針酶混合物、上下游引物(RPA-STLV1F、RPA-STLV1R)各2.1 μL、10 μmol/L熒光探針0.6 μL；混勻后，再加入2.5 μL 20倍核心反應液、1 μL 50倍RT反應液、1 μL 50倍Exo反應液；混勻后，最后加入2.5 μL 280 mmol/L醋酸鎂、1 μL待檢核酸溶液。反應條件為：39 ℃孵育25 min。反應結束后，查看熒光擴增曲線進行結果判定。

2 結果

2.1 RPA和熒光RPA檢測STLV-1的特異性試驗

分析STLV-1 gag蛋白基因序列，設計引物及探針，分別建立STLV-1的 RPA和熒光RPA方法，并分別使用猴的其它病毒(如SIV、BV、SRV)作為對照，同時與PCR方法進行對比，確認所建立方法的特異性。結果顯示，經RPA、PCR檢測，僅有STLV-1陽性樣品出現特異性擴增，其它對照病毒樣品均呈陰性(圖1、圖2)；經熒光RPA檢測，STLV-1陽性樣品在反應15～20 min后熒光信號出現顯著增強，而對照病毒樣品檢測到熒光信號(圖3)。

圖1 RPA檢測STLV-1的特異性注：M:DNA Marker DL2000；1:STLV-1陽性樣品1；2:STLV-1陽性樣品2；3:SRV；4:SIV；5:沙門氏菌； 6：志賀氏菌；7：空白對照Fig.1 Specificity test of STLV-1 by RPANote：M：DNA Marker DL2000；1：STLV-1 positive sample 1；2：STLV-1 positive sample 2；3：SRV； 4：SIV；5：Salmonella；6：Shigella；7：Blank control

圖2 RT-PCR檢測STLV-1的特異性注：M：DNA Marker DL2000；1：STLV-1陽性樣品1；2：STLV-1陽性樣品2；3：SRV；4：SIV；5：沙門氏菌； 6：志賀氏菌；7：空白對照Fig.2 Specificity test of STLV-1 by RT-PCRNote：M：DNA Marker DL2000；1：STLV-1 positive sample 1；2：STLV-1 positive sample 2；3：SRV； 4：SIV； 5：Salmonella；6：Shigella；7：Blank control

圖3 熒光RPA檢測STLV-1的特異性注：M：DNA Marker DL2000；1：STLV-1陽性樣品1；2：STLV-1陽性樣品2；3：SRV；4：SIV；5：沙門氏菌；6：志賀氏菌；7：空白對照Fig.3 Specificity test of STLV-1 by fluorescent RPANote：M：DNA Marker DL2000；1：STLV-1 positive sample 1；2：STLV-1 positive sample 2；3：SRV；4：SIV；5：Salmonella；6：Shigella；7：Blank control

2.2 RPA和熒光RPA檢測STLV-1的敏感性試驗

為測試所建立的RPA和熒光RPA方法的敏感性，將STLV-1陽性樣品cDNA進行定量并梯度稀釋，制備濃度分別為10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL的模板，再分別用建立的兩種方法和RT-PCR方法進行檢測。結果證實，RPA和熒光RPA方法的檢測下限與RT-PCR相同，均為1 pg/μL ～100 fg/μL(圖4～圖6)。

圖4 RPA檢測STLV-1的敏感性試驗注：M：DNA Marker DL2000；1～8：STLV-1 cDNA模板量分別為10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μLFig.4 Sensitivity test of STLV-1 by RPANote：M：DNA Marker DL2000；1～8：The amount of STLV-1 cDNA was 10 ng/μL, 1 ng/μL, 100 pg/μL, 10 pg/μL, 1 pg/μL, 100 fg/μL, 10 fg/μL and 1 fg/μL

圖5 RT-PCR檢測STLV-1的敏感性試驗注：M：DNA Marker DL2000；1～8：STLV-1 cDNA模板量分別為10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μLFig.5 Sensitivity test of STLV-1 by RT-PCRNote：M：DNA Marker DL2000；1～8：The amount of STLV-1 cDNA was10 ng/μL, 1 ng/μL, 100 pg/μL, 10 pg/μL, 1 pg/μL, 100 fg/μL, 10 fg/μL and 1 fg/μL

圖6 熒光RPA檢測STLV-1的敏感性試驗注：擴增曲線從左至右分別為10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL的STLV-1 cDNA模板Fig.6 Sensitivity test of STLV-1 by fluorescent RPANote：The amplification curve from left to right is the amount of STLV-1 cDNA from 10 ng/μL, 1 ng/μL, 100 pg/μL, 10 pg/μL, 1 pg/μL, 100 fg/μL, 10 fg/μL to 1fg/μL

2.3 RPA和熒光RPA檢測STVL-1的可靠性試驗

為進一步驗證建立核酸檢測方法的的可靠性，對將本室保存的經RT-PCR確認的7份STLV-1陽性核酸樣本及23份STLV-1陰性猴血清分別用RPA和熒光RPA 進行檢測，每份樣同一方法重復3次。結果顯示，7份陽性核酸樣本經上述三種方法檢測均得到了陽性結果，而陰性樣本均未出現特異性擴增，與實際樣本的符合率為100%(圖7、圖8)。

圖7 RPA檢測7份不同時期分離的STLV-1陽性樣品注：M：DNA Marker DL2000；1～7：7份STLV-1陽性樣品；8：空白對照Fig.7 RPA Detection of seven positive samplesof STLV-1 seperated at different timeNote：M：DNA Marker DL2000；1～7：7 positive samples of STLV-1；8：Blank control

圖8 熒光RPA檢測7份不同時期分離的STLV-1陽性樣品注：擴增曲線為7份不同時期分離的STLV-1陽性樣品Fig.8 Fluorescent RPA Detection of seven positive samplesof STLV-1 seperated at different timeNote：The amplification curve shows seven positive samples of STLV-1 seperated at different time.

3 討論

由于猴在形態、生理、生化、代謝等諸多方面與人類非常相似，因而作為理想的實驗動物模型被應用于生物醫藥研究領域。國際上對無特定病原體(SPF)猴的定義主要指體內不含STLV、SIV、SRV、猴B病毒(BV)、沙門氏菌、志賀氏菌等特定病原微生物。由于實驗用猴進出口貿易的不斷擴大，縮短檢疫周期，研發簡便、快速、特異、敏感的新型檢測方法，對提高猴特定病原體篩查的效率，保證進出境實驗用猴的健康和質量具有重要意義。

本研究建立了RPA和熒光RPA快速檢測STLV-1的方法，通過將猴其它特定病原體與STLV-1對比檢測，證實建立的檢測方法具有良好的特異性。經靈敏度試驗證實，本研究建立的兩種STLV-1核酸檢測方法，與傳統PCR檢測方法一樣，均具有很高的敏感性。通過對30份STLV-1陽性核酸樣本及陰性猴血清樣本的重復檢測，證實建立的RPA和熒光RPA，具有PCR方法一樣的穩定性和可靠性。但是與PCR方法相比，RPA檢測方法的優勢在于檢測周期極短(僅需20 min)、操作簡單(只需將核酸與檢測體系混合放于恒溫設備中即可，RNA檢測不需逆轉錄過程)、檢測設備便攜(筆記本大小，一次充電可運行12 h)、結果判定簡便直觀，適合于現場及野外操作。