注射用促肝細胞生長素中組胺類物質檢查和降壓物質檢查的比較研究*

吳賢生 黃甘泉 楊嘉俊 王鳳姬 嚴家榮 鐘志勇 鄺少松

(廣東省醫學實驗動物中心 佛山 528248)

促肝細胞生長素(hepatocyte growth-promoting factors, HGPF)是從新鮮乳豬健康肝臟中提取的多肽和核苷酸制品，具有促進肝臟細胞分裂生長，加速損傷肝臟的修復的作用[1-2]。HPGF在臨床上廣泛用于治療肝炎、肺纖維化和心、腎血管疾病[3]，同時相關不良反應報道也日益增多[4-5]。低血糖是促肝細胞生長素的常見臨床不良反應，并常伴隨血壓下降、出冷汗、惡心嘔吐、心慌、意識改變、四肢冰冷和煩躁等癥狀[5]。

組胺、緩激肽一類的物質因具有血管擴張作用，在注入機體后易引起血壓快速下降。來自動、植物、微生物發酵提取物及生產過程中有可能混入組胺類或類組胺類物質的原料和注射劑(靜脈)應建立降壓物質檢查項，如抗生素、中藥注射劑、氨基酸和多肽類[6]。近3版《中國藥典》(2005年版、2010年版和2015年版)中降壓物質檢查方法均是通過比較藥物和標準品引起動物血壓變化的大小進行判定降壓物質是否合格，所選用實驗對象為貓。然而當前我國未建立實驗貓的繁殖、培育和檢驗相關標準，用于降壓物質檢查的家貓均為非標準化實驗動物，其個體差異不可控制，健康狀況無法保證，同時因這些家貓常常攜帶寄生蟲和微生物，對實驗結果以及實驗人員的安全均產生威脅和影響[7-9]。《中國藥典》2015年版正式將組胺類物質檢查法(豚鼠離體回腸法)收錄為通則之一，作為降壓物質檢查法的補充和替代方法[10]。推廣組胺類物質檢查法替代現有的降壓物質檢查法，必將大量減少貓在降壓物質檢查中的應用。

現代藥物生產工藝的改進以及對相關物質的控制，使得我們難以獲得明顯引起機體血壓下降的藥品，以陰性樣品進行探討檢查方法，會增大假陽性的可能；采用加標方法進行研究和檢查，會增大假陰性的可能。我中心在進行藥物安全性檢查時，偶然發現3個批次引起動物血壓明顯下降但仍滿足《中國藥典》中關于降壓物質檢查要求的注射用促肝細胞生長素。注射用促肝細胞生長素的降壓物質檢查標準已經制定，而組胺類物質檢查標準未見報道。本實驗旨在通過比較這些批次的注射用促肝細胞生長素組胺類物質檢查法和降壓物質檢查法結果的異同，探討在注射用促肝細胞生長素安全性檢查中，以組胺類物質檢查法替代降壓物質檢查法的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級豚鼠，體質量250～350 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(粵)：2013-0002。家貓，購買于廣東省佛山市南海區黃岐周邊農村。

1.2 藥品與試劑

注射用促肝細胞生長素，批號：16010101、16010301、16010501；磷酸組織胺，中國藥品生物制品檢定所；戊巴比妥鈉，德國默克公司；肝素鈉，廣東晶欣生物科技有限公司；鹽酸賽拉嗪注射液，吉林省方正動物藥業科技有限責任公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉，廣州市中南化學試劑有限公司；碳酸氫鈉，天津市大茂化學試劑廠；氯化鈣，廣州化學試劑二廠；氯化鎂(含6個結晶水)、葡萄糖(含1個結晶水)，天津市福晨化學試劑廠；硫酸阿托品注射液，吉林省華牧動物保健有限公司；滅菌注射用水，四川科倫藥業股份有限公司；0.9%氯化鈉注射液，貴州天地藥業有限公司；去離子水，由廣東省醫學實驗動物中心生產；氧氣和二氧化碳混合氣體(O2∶CO2=95∶5)，廣州珠江氣體有限公司產品。

1.3 儀器

BL-420F/S生理機能儀，成都泰盟科技有限公司；恒溫HW-400E恒溫平滑肌槽，成都泰盟科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1降壓物質檢查法：參照《中國藥典》2015年版. 四部. 通則1145 降壓物質檢查法進行。動物對降壓物質靈敏度檢查符合要求后，取對照品溶液(dS)按0.10μg/kg體質量劑量，供試品溶液(dT)按2 mg/kg體質量劑量注射，照下列次序注射一組4個劑量：dS1、dT1、dT2、dS2，然后以dS1與dT2、dT1與dS2劑量所致的反應分別比較，依照《中國藥典》2015年版中判定標準對受試樣品降壓物質檢查結果進行判定。

1.4.2組胺類物質檢查：參照《中國藥典》2015年版. 四部. 通則1 146組胺類物質檢查法進行。

(1)組胺類物質檢查中對照品高低濃度確定：按照對照品浴槽終濃度從小到大的次序，將對照品依次加入浴槽(浴槽體積為20 mL)，注射量均為0.2 mL。根據豚鼠離體回腸的收縮反應，選擇其中能引起豚鼠離體回腸收縮的2個劑量設定為高、低劑量，低劑量能引起豚鼠離體回腸明顯收縮，高劑量不致使回腸收縮達到極限，且高低劑量所致回腸的收縮有明顯差別，高低劑量比為1∶0.5左右，高、低劑量分別標示為dS2和dS1。

(2)組胺類物質檢查理論限值確定：根據中國藥典委員會發布《注射劑安全性檢查法應用指導原則》，組胺類物質檢查原則上與降壓物質檢查限值一致。根據國家藥品標準WS1-10001-(HD-0828)-2002規定[11]，注射用促肝細胞生長素降壓物質檢查注射劑量為2 mg/kg，對應組胺標準品劑量為0.10 μg/kg，則dT=20 000 dS。

(3)組胺類物質檢查和判定：照下列次序準確注入浴槽6個劑量：dS2、dS1、dT、dT、dS1、dS2，如dS2所致的反應值大于dS1所致的反應值并且可重復時判定試驗有效。

(4)干擾實驗：按照限值劑量在注射用促肝細胞生長素溶液中加入組胺對照品高、低劑量，并按下列次序準確注入dS2、dS1+T、dS2+T、dS1，重復一次，研究注射用促肝細胞生長素對回腸收縮的干擾。

(5)注射用促肝細胞生長素組胺類物質檢查靈敏度實驗：分別將0.2、0.5、1、2、5、10 mg/mL的注射用促肝細胞生長素溶液注入浴槽，注射體積均為0.2 mL，研究不同濃度劑量下豚鼠離體回腸的收縮情況。

2 結果

2.1 降壓物質檢查結果

以2 mg/kg的注射劑量將促肝細胞生長素注入貓體內后，均引起了貓血壓的下降，下降幅度約為對照品的50%。3個批次藥品的降壓物質檢查結果如表1所列，并選擇其中1個批次藥品降壓物質檢查過程中貓血壓的變化情況進行繪圖，見圖1。3批注射用促肝細胞生長素在降壓物質檢查中，藥品引起的貓血壓下降值均小于相應對照品引起的血壓下降值，根據《中國藥典》2015年版相關標準，可判定3批注射用促肝細胞生長素降壓物質檢查均合格。

圖1 注射用促肝細胞生長素(批號：16010101)組胺類物質檢查試驗結果Fig.1 Result of depressor substance test of hepatocyte growth-promoting factors for injection (Lot No. 16010101)

藥品批號輪次組胺注射用促肝細胞生長素劑量/(μg/kg)dS1/kPadS2/kPa劑量/(mg/kg)dT1/kPadT2/kPa16010101第1輪0.13.263.0721.531.72第2輪0.13.182.9021.601.9516010301第1輪0.14.415.0822.002.84第2輪0.15.314.2422.341.6816010501第1輪0.13.604.6322.483.10第2輪0.14.435.7022.683.26

2.2 組胺類物質檢查結果

(1)不同濃度組胺對回腸收縮的影響：往離體浴槽中分別依次加入不同劑量的組胺溶液，觀察并記錄豚鼠離體回腸收縮情況。不同劑量組胺引起豚鼠回腸張力變化結果如表2，并將這一過程豚鼠離體回腸張力變化情況進行繪圖見圖2。隨后選擇浴槽組胺終濃度0.1 μg/mL為低劑量對照(dS1)，0.2 μg/mL為高劑量對照(dS2)，進行2輪注射驗證，高低劑量差別明顯且重復性好(表2、圖2)，故在后期組胺類物質檢查中選擇這兩個劑量作為高、低劑量。

表2 不同濃度組胺對豚鼠離體回腸收縮張力影響Table 2 Contractility of isolated ileum that caused byhistamine of different concentration

(2)注射用肝細胞生長素組胺類物質檢查限值計算：降壓物質檢查中，組胺對照品注射劑量為0.1 μg/kg，對應促肝細胞生長素注射劑量為2 mg/kg。組胺類物質檢查原則上與降壓物質檢查限值一致，則組胺類物質限值dT=20 000 dS，選定dS1浴槽終濃度為0.01 μg/mL，則dT=0.2 mg/mL，注射用肝細胞生長素溶液濃度為20 mg/mL。

(3)組胺類物質檢查：組胺類物質檢查中，dS2引起回腸收縮明顯大于dS1，且可重復，結果成立。3個批次藥品的組胺列物質檢查結果如表3所列，選擇其中1個批次的檢查結果繪制豚鼠離體回腸張力變化圖，見圖3。注射注射用促肝細胞生長素溶液后，豚鼠回腸未見收縮，需按照限值劑量在供試品溶液中加入組胺對照品高、低劑量進行干擾實驗。

圖2 不同濃度的組胺對照品對豚鼠離體回腸收縮張力的影響Fig.2 Contractility of isolated ileum that caused by histamine of different concentration

藥品批號離體回腸收縮力/gdS2dS1dTdTdS1dS2160101013.872.45002.364.02160103014.122.65002.544.07160105014.202.41002.663.97

圖3 注射用促肝細胞生長素(批號：16030101)組胺類物質檢查結果Fig.3 Result of histamine-like substance test of hepatocyte growth-promoting factors for injection (Lot No. 16010101)

(4)干擾實驗結果：依次注入dS2、dS1+T、dS2+T、dS1，重復一次，各批次檢查結果如表4所列，選擇其中1個批次的檢查結果繪制豚鼠離體回腸張力變化圖，見圖4。注射用促肝細胞生長素-組胺溶液產生的收縮與對應組胺對照品高、低劑量的收縮基本一致，可排除注射用促肝細胞生長素-組胺溶液對離體回腸的干擾。根據《中國藥典》2015年版相關判定標準，可認為注射用促肝細胞生長素組胺類物質檢查合格。

表4 注射用促肝細胞生長素組胺類物質檢查干擾實驗結果Table 4 Result of interference experiment for histamine-like substance test of hepatocyte growth-promoting factors for injection

2.3 注射用促肝細胞生長素降壓物質檢查與組胺類物質檢查結果比較

依照《中國藥典》2015年版中的檢查方法和判定標準，3批注射用促肝細胞生長素降壓物質檢查和組胺類物質檢查結果均為符合規定。但從實驗過程中我們發現，在降壓物質檢查中供試品引起了貓血壓的明顯下降。以供試品引起貓血壓下降的均值/對照品引起貓血壓下降均值，計算二者引起貓血壓變化的比例，則3批供試品所致貓血壓下降分別是對照品的54.8%、46.5%和62.7%。而在組胺類物質檢查過程中，供試品并未引起豚鼠離體回腸的收縮，也未對回腸對組胺的靈敏度產生干擾，根據檢查法中判定標準雖可判定組胺類物質檢查合格，但與降壓物質檢查結果相比較，組胺類物質檢查結果未能較好地反應出供試品對動物血壓帶來的影響。

圖4 注射用促肝細胞生長素(批號：16010101)組胺類物質檢查干擾實驗結果注：dS2濃度：0.02 μg/mL；dS1濃度：0.01 μg/mL；dT濃度：0.2 mg/mL(浴槽濃度)Fig.4 Result of interference experiment for histamine-like substance test of hepatocytegrowth-promoting factors for injection (Lot No. 16010101)Note： dS2: 0.02 μg/mL; dS1: 0.01μg/mL and dT: 0.2 mg/mL (final concentration)

3 討論

組胺類物質檢查法作為降壓物質檢查法的補充和替代，被《中國藥典》2015年版正式收錄。推廣組胺類物質檢查法將有利于規范和減少非標準化貓的使用，符合動物倫理和3R原則，同時也可使實驗質量得到保障。但目前已經建立起組胺類物質檢查方法的藥品品種甚少，組胺類物質檢查標準的建立，尤其是限值劑量的設定仍需大量工作推進。

在本次實驗中，對降壓物質檢查和組胺類物質檢查結果進行比較后我們發現在降壓物質檢查中呈陽性結果(引起貓血壓明顯下降)的3批注射用促肝細胞生長素組胺類物質檢查結果均呈陰性。此結果提示3批供試品中所含組胺的量均低于限值，則在整體水平上的降壓物質檢查過程中，是什么物質導致了貓血壓的下降？同樣的情況在中藥注射劑檢查中也有出現[12]。我們推測可能是藥物注射入貓體內后，引起了內源性的組胺類物質釋放，從而導致貓血壓下降。而內源性組胺類物質如何定位和檢測，仍需進一步研究。

本實驗中，降壓物質檢查和組胺類物質檢查結果的差異提示組胺類物質檢查合格時，仍可能會有降壓物質檢查不滿足規定的情況出現，所以體外實驗的結果不能簡單地擴推到體內實驗。同時反推回來，在組胺類物質檢查方法學研究過程中，應用降壓物質檢查結果陰性的供試品進行組胺類物質檢查的方法學研究，可能會增大假陽性結論的可能性。在未能充分驗證注射劑組胺類物質檢查結果的有效性以及和降壓物質檢查結果的一致性時，不能簡單地以組胺類物質檢查來代表降壓物質檢查結果。