血漿抗凝血酶和炎癥meijiangneirong平分析

宋孝鵬

洛陽北方企業集團有限公司職工醫院內科(河南 洛陽 471000)

腦梗死是因急性缺血、缺氧導致的局部或彌漫性腦組織損傷的血管性事件，發病率和致死率位列我國前三[1]。研究發現，體內凝血和抗凝系統平衡失調在腦梗死發病過程中發揮著重要的促進作用[2]。

血漿抗凝血酶(AT-Ⅲ)是具有絲氨酸酶抑制活性的糖蛋白，可調節血漿生理性凝血功能[3]。相關研究顯示，炎癥與凝血系統之間存在明顯相互作用，促炎因子是主要橋梁[4]。本研究通過檢測110例腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性和TNF-α、IL-6水平，探討其在腦梗死病情發展中的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2016年3月至2017年10月間本院神經內科收治的腦梗死患者110例為研究組。均經CT或MRI確診為腦梗死，NIHSS評分>2分，從發病到采集血標本的時間間隔≤48h。其中男性70例，女性40例，年齡32～81歲，平均(65.38±9.72)歲。選取同期在本院體檢的健康人群110例為對照組，其中男性60例，女性50例，年齡30～78歲，平均(64.51±6.93)歲。兩組受試者一般資料間差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準，均簽署知情同意書，且排除1個月內有手術史、外傷史、口服避孕藥，合并腎病綜合征、血液系統疾病、肝病的受試者。

1.2方法

1.2.1 標本采集與制備

抽取受試者清晨空腹肘靜脈血，部分全血用于分離外周血單核細胞，具體為：Hanks液稀釋1倍后加入淋巴細胞分離液，收集單核細胞層，用含血清的DMEM培養液調整細胞濃度至1×1010/L；加入96孔板中，200μL/孔，培養過夜，棄去懸浮細胞，貼壁細胞為單核細胞。另取3.6mL全血加入枸櫞酸鈉0.4mL抗凝管中，離心收集血漿，測定AT-Ⅲ活性；取肝素抗凝血漿，分別檢測免疫復合物、THF-α、IL-6以及常規生化項目。

1.2.2 血生化指標檢測

邁瑞普利生全自動血凝儀C2000-A檢測AT-Ⅲ活性，配套試劑(凝血酶、底物、凝血酶溶劑)購于上海威奧生物科技有限公司。全自動生活分析儀檢測空腹血糖、血脂四項、同型半胱氨酸水平。使用EIA試劑盒檢測血漿免疫復合物水平，Elisa法檢測血漿TNF-α、IL-6水平，試劑盒購于上海仁捷生物科技有限公司。

1.2.3 單核細胞數量和表型檢測

取對數期單核細胞，緩沖液重懸細胞，分別經CD14、CD16、CD32、CD64單克隆熒光抗體染色，上流式細胞儀檢測單核細胞數量和表型。使用GraphPadPrsim5軟件定量分析單核細胞表面分子表達情況。

1.2.4 免疫復合物刺激單核細胞后TNF-α、IL-6檢測

12孔板中加入1mL人類IgG孵育過夜，磷酸緩沖液洗滌后，與800μL的小鼠抗人IgG共孵育60min。制備好的孔板加入外周血單核細胞之前用磷酸緩沖液洗滌。將單核細胞加入不同濃度Ig-IC復合物(0～1000mg/L)的12孔板中培養16h，離心取上清液，Elisa法測定TNF-α、IL-6濃度，以人類IgG為對照。

2 結果

2.1兩組患者血漿AT-Ⅲ活性水平及臨床資料比較 研究組患者血漿AT-Ⅲ活性為(85.83±9.26)%，低于對照組的(98.24±10.52)%，差異有統計學意義(P<0.05)。研究組患者TC、TG、LDL-C、同型半胱氨酸水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

注：與對照組相比，aP<0.05

2.2血漿AT-Ⅲ活性與腦梗死危險因素的相關性分析 將血壓、空腹血糖、血脂指標、同型半胱氨酸為自變量，血漿AT-Ⅲ活性為因變量，進行線性相關性分析，結果顯示，腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性與收縮壓、舒張壓、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、同型半胱氨酸呈負相關(r=-0.29、-0.46、-0.38、-0.86、-0.72、-0.91，P<0.05)；與HDL-C呈正相關(r=0.57，P<0.05)。

2.2血漿免疫復合物及TNF-α、IL-6水平比較 研究組血漿免疫復合物水平為高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；研究組TNF、IL-6水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 兩組血漿免疫復合物及TNF-α、IL-6水平比較

注：與對照組相比，aP<0.05

2.3外周血單核細胞表面標志物水平比較

流式細胞術檢測顯示，CD14+CD16+、CD14+CD32+單核細胞比例在兩組間差異無統計學意義(P>0.05)；研究組CD14+CD64+單核細胞比例高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組外周血單核細胞表面標志物水平比較

注：與對照組相比，aP<0.05

2.4免疫復合物刺激對外周血單核細胞TNF-α、IL-6分泌的影響 加入的Ig-IC復合物濃度在0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L時外周血單核細胞TNF-α、IL-6的分泌量均隨著Ig-IC復合物濃度的增加而提升。見表4。

表4 免疫復合物刺激對外周血單核細胞TNF-α、IL-6分泌的影響

3 討論

腦梗死發病過程中，血管病變引發內膜損傷形成潰瘍，血小板等血液中有形成份聚集并釋放出促凝因子，同時膽固醇、脂蛋白等含量增加，導致血粘度升高，血流速變慢，腦組織出現局部缺血癥狀。因此，腦梗死的發生與凝血系統和抗凝系統平衡失調有關。AT-Ⅲ為肝臟合成的糖蛋白，具有絲氨酸酶抑制活性，作用于多種含絲氨酸酶凝血因子的活性中心，是體內抑制凝血的關鍵物質，維持抗凝和纖溶系統與凝血系統的平衡狀態，約占血漿抗凝血酶活性的60%[5]。本研究中腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性下降，與凝血功能亢進及相關酶大量消耗有關。腦梗死危險因素與血漿AT-Ⅲ活性相關性分析顯示，血壓、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、同型半胱氨酸呈負相關，與HDL-C呈正相關，提示血漿AT-Ⅲ活性檢測有助于腦梗死病情防治。近年來大量研究顯示，炎癥與凝血系統存在明顯關聯，其中促炎因子發揮重要橋梁作用[6]。TNF-α多由T細胞、巨噬細胞分泌，參與局部炎癥反應，在凝血系統激活中發揮調節作用；IL-6是可激活凝血系統的促炎因子。本研究顯示，腦梗死患者血漿TNF-α、IL-6水平高于健康對照組，可能與血漿AT-Ⅲ活性下降有關。炎癥反應是腦組織血管硬化斑塊形成的主要病理基礎[7-8]。組織病理學檢查顯示，斑塊中存在巨噬細胞、單核細胞、淋巴細胞的相互作用，在動脈硬化及斑塊不穩定性炎癥過程中發揮重要作用[9-10]。本研究中也發現腦梗死患者血漿病理產物的免疫復合物水平明顯高于對照組，為進一步分析細胞因子和免疫反應在腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性變化中的作用，本研究分離了患者外周血單核細胞，檢測其表面標志物結果顯示，研究組CD14+CD64+單核細胞比例高于對照組，提示腦梗死患者體內免疫復合物可能通過結合CD14+CD64+單核細胞，分泌大量促炎細胞因子，改變AT-Ⅲ活性。為進一步驗證上述結論，探討AT-Ⅲ在腦梗死患者中變化的機制，本研究在體外模擬了免疫復合物，觀察不同濃度免疫復合物對外周血單核細胞TNF-α、IL-6分泌的影響，結果顯示，隨著免疫復合物濃度的增加，TNF-α、IL-6分泌水平明顯升高，提示血液中受刺激的單核細胞是腦梗死患者體內高水平的促炎因子的主要來源，可不同程度低損傷血管內皮細胞，降低抗凝因子合成量，可能為血漿AT-Ⅲ活性降低的原因。

綜上所述，腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性明顯下降，是腦梗死發生、發展的危險因素之一，且與病情嚴重程度相關，可作為腦梗死臨床診治的參考指標。其可能機制為免疫復合物經CD14+CD64+單核細胞介導促炎因子分泌，損傷血管內皮細胞，抑制AT-Ⅲ合成。