孤立低高密度脂蛋白膽固醇表型與血漿miR-9-3p、miR-28-5p的表達分析

孫澤寧,吳 冰,2,劉夢迪,李金榮,田 衛,2,周云濤,2△

(1.華北理工大學附屬唐山市工人醫院，河北唐山 063000;2.唐山市臨床分子診斷與治療重點實驗室，河北唐山 063000；3.保定市第一中心醫院，河北保定 071000)

孤立低高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)表型是一種單純的HDL-C水平減低，而三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)值正常的一種表現[1]。孤立低HDL-C表型在亞裔人種中的發生率高于非亞裔人種，與冠心病、卒中的風險增加相關[2]。不僅如此，心血管疾病治療過程中，盡管他汀類藥物強化治療已經進一步減低了心血管事件和病死風險，但是“剩留風險”問題卻更加凸顯出來[3]。低HDL-C血癥是“剩留風險”發生的重要因素之一。近年來，低HDL-C表型與相關疾病間的分子機制研究已經成為脂代謝領域中的一個重要部分。

miRNA是一類長約22個核苷酸的非蛋白編碼的RNA。通過轉錄后翻譯抑制作用，在分子水平參與基因表達和調控。miRNA9(miR-9)是一個靶向調節沉默信息調節因子2家族基因sirtuin-1(SIRT1)的RNA分子，參與糖代謝和脂代謝途徑的調節，與胰島素抵抗關系密切[4]。研究顯示，孤立低HDL-C表型人群，除了低HDL-C水平外，也常伴有胰島素抵抗特征。MIR28是一個通過靶向抑制ERK2，上調HDL-C代謝調節關鍵基因三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ABCA1)的RNA分子，在HDL-C代謝途徑發揮作用[5]。本研究旨在利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)技術，檢測miR-9-3p和miR-28-5p在孤立低HDL-C表型人群血漿中的表達水平，并探討其與血清HDL-C水平的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取唐山市工人醫院2014年1月至2015年12月健康體檢者共174例，其中脂代謝表型正常組86例和孤立低HDL-C表型異常組88例。分組參照中國脂代謝異常防治指南、唐山地區健康居民體檢血清HDL-C分布特征等[6]，TG<1.7 mmol/L和LDL-C<3.30 mmol/L、血清HDL-C<1.04 mmol/L(男性)或1.16 mmol/L(女性)判別為孤立低HDL-C表型異常組。排除標準：糖尿病、心腦血管病史、代謝綜合征等病史。本研究經唐山市工人醫院倫理委員會批準，征得受試者的知情同意，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血漿RNA提取 參照mirVana RNA分離試劑盒(美國Ambion公司)操作手冊。簡易操作流程如下：(1) 兩步離心法分離血漿樣本(4 ℃，3 000 r/min離心15 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min)；(2) 500 μL血漿，經過變性液、酸化苯酚、無水乙醇、洗脫液等處理步驟，分離液相至RNeasy Mini吸附柱內；(3)加入預熱90 μL稀釋液，靜置1 min，8 000×g離心1 min。經血漿RNA分離，起始體積500 μL的血漿樣本轉化為90 μL RNA樣本。

1.2.2血漿miRNA qPCR檢測 利用TaqMan miRNA反轉錄試劑盒、TaqMan miRNA檢測試劑盒、TaqMan通用PCR試劑盒(美國ABI公司)，完成miRNA反轉錄和PCR定量檢測(ABI 7500定量PCR儀,美國ABI公司)。反轉錄反應體系包括：8.6 μL RNA，0.1 μL 100 mmol/L dNTPs，0.1 μL RNase inhibitor (20 U/μL)，1.5 μL miRNA特異度引物,0.5 μL MultiScribeTM反轉錄酶 (50 U/μL)；反轉錄反應步驟：16 ℃孵育1 h；42 ℃孵育 1.5 h；85 ℃孵育5 min。定量PCR擴增體系包括：6 μL 反轉錄產物，10 μL 2×TaqMan通用PCR緩沖液，0.5 μL TaqMan miRNA水解探針(2.5 μmol/L)，3.5 μL H2O(無RNA酶和DNA酶)；反應條件：95 ℃變性15 s，60 s退火/延伸1 min，共50個循環。miRNA相對表達定量分析以miR-191-5p為參照，采用ΔCt方法，計算相對表達水平，2-ΔCt表示血漿樣本中的相對表達量。

2 結 果

2.1孤立低HDL-C表型組與脂代謝表型正常組一般資料比較 一般臨床資料如表1所示，兩組間TC、TG和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)血清水平，差異有統計學意義，但均在正常參考值范圍。

表1 研究對象的臨床特征

注：TC為總膽固醇;HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇;LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇;TG為三酰甘油;FG空腹血糖;ALT為丙氨酸氨基轉移酶;AST為門冬氨酸轉氨酶;GGT為谷氨酰轉肽酶;HGB為血紅蛋白濃度;PLT為血小板計數;WBC為白細胞;RBC為紅細胞;NEU為中性粒細胞;LYM為淋巴細胞

2.2血漿miR-9-3p和miR-28-5p的檢出率 脂代謝表型正常組和孤立低HDL-C表型組血漿中miR-9-3p的檢出率分別為86.05%(74/86)和64.77%(57/88)，差異有統計學意義(χ2=10.58,P=0.001),見表2，但性別分組條件下，miR-9-3p在各組間的檢出率，差異無統計學意義(χ2=0.66,P=0.882)。miR-28-5p的檢出率分別為94.19%(81/86)和100%(88/88)，差異無統計學意義。表觀健康體檢者血漿中miR-9-3p和miR-28-5p的總檢出率分別為75.29%(131/174)和97.13%(169/174)。

表2 血漿miR-9-3p的檢出率(n)

注：χ2=10.58,P=0.001，有統計學意義

2.3血漿miR-9-3p和miR-28-5p表達水平 如圖1所示，孤立低HDL-C異常表型組與脂代謝正常表型組血漿樣本中miR-9-3p相對表達水平分別為0.024(0.009,0.039)和0.026(0.012,0.065)，差異無統計學意義(P=0.167)，圖1A；miR-28-5p的相對表達水平分別為0.004(0.002,0.010)和0.004(0.002,0.011)，差異無統計學意義(P=0.871)。見圖1B。

圖1 血漿miR-9-3p和miR-28-5p的相對表達水平

注：A為性別與表型交互分組情況下血漿miR-9-3p比較分析；B為性別分組情況下血漿miR-9-3p比較分析；C為性別與表型交互分組情況下血漿miR-28-5p比較分析；D為性別分組情況下血漿miR-28-5p比較分析；●表示正常脂表型；○表示孤立低HDL-C表型

圖2性別分組下血漿miR-9-3p和miR-28-5p的相對表達水平

2.4性別分組情況下，血漿miR-9-3p和miR-28-5p表達水平 如圖2所示，miR-9-3p在女性脂代謝正常組和孤立低HDL-C異常表型組血漿樣本中的表達水平均高于男性組，見圖2A，與未表型分組情況下女性組高于男性組的分析結果相一致[0.038(0.023,0.082)vs.0.014(0.007,0.033),P<0.001]，見圖2B。而在性別和HDL-C異常表型分組條件下，各組間血漿miR-28-5p的差異無統計學意義，見圖2C，僅在未表型分組情況下女性組高于男性組[0.003(0.002,0.008)vs.0.004(0.003,0.011),P=0.028)，見圖2D。

2.5血漿miR-9-3p和miR-28-5p與臨床指標的線性回歸分析 如表3所示，線性回歸分析顯示血漿miR-9-3p與性別因素(P<0.001)、血清HDL-C水平(P=0.041)、空腹血糖(P=0.044)相關，見表3；而miR-28-5p表達水平與血清HDL-C水平、空腹血糖、性別等指標均無相關性。

表3 健康體檢者血漿miR-9-3p的線性回歸分析

注：多元線性回歸模型中包括年齡、血脂、肝功能、血常規細胞絕對計數等指標，非正態分布的數據經自然對數轉換，回歸模型經年齡等因素調整后R2=0.215,P=0.002

3 討 論

孤立低HDL-C表型是心腦血管疾病的一個風險因素。該表型人群常表現出內皮細胞功能紊亂、HDL亞組份功能異常[7]、抗炎作用削弱[8]、血小板過渡活化[9]等病理生理特征，而這些改變與心腦血管疾病的發生與發展關系密切。

研究表明，HDL-C代謝過程中，有多種miRNA參與，包括miR-33[10]，miR-28[11]，miR-144[12]等。研究表明，miR-9調節胰島素分泌[13]，參與膽固醇代謝及心肌細胞血管新生過程[14-15]。冠心病患者常伴有降低的HDL-C水平，并發糖尿病。因此，本研究選取miR-28和miR-9作為研究對象，探討在孤立低高密度脂蛋白膽固醇表型下的血漿miR-9-3p和miR-28-5p變化模式。結果顯示，脂代謝表型正常組和孤立低HDL-C表型組血漿中miR-9-3p的檢出率分別為86.05%(74/86)和64.77%(57/88)，差異有統計學意義，同時在女性脂代謝正常表型組和孤立低HDL-C表型組的表達水平均高于男性表型組，差異均有統計學意義。然而，在不考慮性別因素情況下，脂代謝正常表型和孤立低HDL-C表型組間差異無統計學意義。線性回歸分析顯示性別、血清HDL-C水平和空腹血糖水平是血漿miR-9-3p的主要影響因素，尤其是性別因素，支持了血漿miR-9-3p在脂代謝正常表型和孤立低HDL-C表型中的分布特征。國內外對于孤立低高密度脂蛋白表型的血漿miR-9水平鮮有報道。本研究首次利用孤立低HDL-C表型和正常血脂表型間的微弱差別，證實了血漿miR-9-3p的基線特征及其關聯因素，為其在動脈硬化性疾病和糖尿病的關聯研究提供了基礎數據支持。人類miR-9基因定位于3個不同的染色體(1號、5號和15號)基因座位，增加了其轉錄調控模式復雜性，有可能影響血漿miR-9-3p的分布水平。其不同基因座位對血漿miR-9-3p表達模式的影響有待于進一步深入研究，以期為亞臨床、臨床疾病診療的轉化與應用奠定堅實的基礎。

miR-28屬于內含子型的miRNA分子，與LIM域脂肪瘤優先運輸輔基編碼基因(LPP)協同轉錄加工。研究表明LPP基因及其內含子型miR-28分子與動脈粥樣硬化性疾病關系密切。本研究未發現血漿miR-28-5p在健康體檢血脂正常表型和孤立低HDL-C表型中存在差異，提示血漿miR-28-5p不是孤立低HDL-C表型的分子病理特征。當前HDL-C的亞組分研究提示，抗動脈粥樣硬化的HDL 顆粒是由一組異質亞組分組成，不僅大小和密度不同，其化學成分和生理功能也有所不同[16]。臨床實踐中，冠心病患者常常伴有其他代謝性疾病，如糖尿病、高脂血癥等，其相互關聯的因子十分復雜。借助新型miRNA分子譜系特征，能為孤立低HDL-C表型的診療以及心血管事件風險預測提供新的研究思路和潛在的干預靶標，從而實現心血管疾病的精準醫療。

4 結 論

血漿miR-9-3p是孤立低HDL-C表型的分子病理特征之一。性別、血清HDL-C、空腹血糖是其循環水平變化的主要關聯因素。血漿miR-9-3p在孤立低HDL-C表型的基線特征及其關聯因素的發現，將有助于臨床工作中更加全面地了解心血管疾病風險因素攜帶者亞臨床表型的分子病理特征，為心血管病的早期防控提供潛在的分子靶標。