Lnk基因敲除對葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠結腸炎的影響

張艷青,華 婧,郭俊榮,朱明明,錢佳麗,徐月節,許葉旻,鄧 彬

(1.揚州大學醫學院 病理生理教研室,江蘇 揚州,225009;2.揚州大學附屬醫院 消化內科,江蘇 揚州,225012)

潰瘍性結腸炎(UC)是一種炎癥性腸病，其發病機制尚不清楚。研究[1]認為感染、免疫、遺傳因素是該病的可能發生機制，目前尚無有效治療方法。人類Lnk基因位于12q24,它編碼575個氨基酸，其翻譯的產物Lnk蛋白(SH2B adaptor protein3,SH2B3),屬于接頭蛋白SH2B家族的一員。Lnk蛋白結構主要包括富含脯氨酸的氨基酸區域、PH結構域、SH2結構域和C-末端保守的酪氨酸殘基。Lnk蛋白主要表達于造血細胞和淋巴細胞。Lnk在淋巴細胞和血細胞生成過程中主要起負調節作用。在Lnk敲除小鼠中，B細胞和造血干細胞的產生顯著增加[2]。最近有研究[3]表明,Lnk可調控炎癥相關的免疫細胞增殖及活性，在維持腸道穩態中起關鍵作用，但Lnk在UC中的作用尚不清楚。為了了解Lnk蛋白與UC的關系，本研究選用Lnk敲除小鼠，采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)制作小鼠UC模型，觀察Lnk蛋白對UC的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

健康C57BL/6小鼠12只，購于揚州大學比較醫學中心,Lnk敲除鼠12只，為江蘇省非編碼RNA基礎與臨床轉化重點實驗室所有。所有實驗小鼠鼠齡6～7 周，體質量18～22 g。DSS購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模:12只C57BL/6小鼠隨機分為2組，每組6只。野生型組(WT)為正常對照組，每日進飲用水及飼料，不做處理，共7 d;WT+DSS組為野生型小鼠結腸炎組，每日自由飲用2.5% DSS溶液，共 7 d。Lnk敲除鼠隨機分為2組，每組6只。Lnk敲除鼠組(KO)為Lnk敲除小鼠，每日進飲用水及飼料，不做處理，共7 d;KO+DSS組為Lnk敲除小鼠結腸炎組，飲用2.5% DSS溶液，共7 d。實驗過程中每天對各組小鼠進行稱重、記錄，觀察小鼠排出糞便情況。7 d后取外周血，處死全部小鼠，留取結腸組織做組織切片。

1.2.2 結腸炎癥的評價:為了評估結腸炎的嚴重程度，每天檢測體質量變化率和小鼠糞便性狀。體質量變化率=(每天體質量-實驗第1天體質量)/實驗第1天體質量×100%。正常小鼠糞便為干而小粒狀，半稀便為糊狀但不粘肛門，稀便為液狀而且粘肛門。觀察糞便顏色，是否有黑便及血便。小鼠腸組織切片觀察結果評價參照組織損傷評分標準[4],包括表面上皮細胞缺失、隱窩腺體損壞、黏膜炎癥細胞浸潤，分為0～4分，其中0分表示組織學特征為無改變;1分表示局部較輕;2分表示局部中等程度;3分表示廣泛中等程度;4分表示廣泛且嚴重。

1.3 統計學處理

采用Graph Pad Prism 5軟件進行數據處理和統計學分析，所有數據均以均數±標準差表示，組間差異采用q檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠一般狀況

WT組與KO組小鼠反應靈敏，飲食、活動正常，毛發有光澤，無便血。WT+DSS組小鼠在飲用2.5% DSS溶液后第5～6天出現懶動、稀便、糞便發黑及便血，進食和飲水量減少。KO+DSS組小鼠于第4～5天出現上述癥狀，且癥狀加重。

2.2 小鼠體質量變化率

WT組與KO組體質量略有增加,WT+DSS組與KO+DSS組體質量均顯著降低(P<0.05),其中KO+DSS組體質量變化率顯著大于WT+DSS組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠體質量變化率

2.3 小鼠腸長度比較

WT組與KO組小鼠腸外形正常，腸長度分別為(9.70±0.16)cm與(9.13±0.98)cm,2組比較無顯著差異(P>0.05)。WT+DSS組與KO+DSS組小鼠腸均有糜爛出血、淤血，長度分別為(6.77±0.17)、(5.10±0.25)cm,與WT組、KO組比較均顯著縮短(P<0.05),其中KO+DSS組較WT+DSS組顯著縮短(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠腸的長度

2.4 腸組織切片觀察

WT組與KO組腸組織切片顯示腸組織黏膜完整，腺體結構清楚;WT+DSS組呈多病灶淺潰瘍，炎性細胞浸潤黏膜及黏膜下層;KO+DSS組呈多病灶淺潰瘍，明顯炎細胞浸潤，累及肌層。各組腸組織蘇木精-伊紅染色法(HE)鏡下表現見圖3。

圖3 各組腸組織HE染色鏡下表現

2.5 小鼠外周血中調節性B細胞(Breg)的細胞頻率檢測

取WT小鼠和KO小鼠的外周血，采用CD19與黏蛋白域基因-1(TIM-1)以及CD19與CD1d陽性標記檢測Breg細胞頻率，發現KO小鼠外周血中Breg細胞頻率顯著低于WT組(P<0.05)。見圖4。

3 討 論

UC是一種原因不明的慢性非特異性炎性疾病，臨床主要表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等,UC病變通常累及直腸和乙狀結腸，侵及黏膜及黏膜下層，呈連續彌漫性分布，病情輕重不一，遷延不愈，嚴重影響患者生活質量。UC的病因及發病機制尚未完全闡明，多數研究[5]認為與免疫、遺傳、感染和精神等因素有關。以淋巴細胞為主的免疫細胞參與慢性非特異性炎癥，與UC密切相關，而Lnk蛋白在淋巴細胞的擴增和功能中起關鍵調控作用。在對乳糜瀉疾病的研究[6-7]中發現,Lnk基因多態性可使細胞產生對細菌感染的強烈反應，說明其對腸道具有抗細菌感染的保護性作用。因此,Lnk不僅可以作為UC的預測分子，也可以作為一個潛在的治療靶點。

圖4 野生型和Lnk敲除鼠外周血中Breg細胞頻率比較

Lnk可防止CD8+T細胞過度增殖，在Lnk敲除小鼠中,CD44hiIFN-γ+CD8+T細胞增多，小腸絨毛變短。CD8+T細胞增殖能力增強，提示Lnk在免疫細胞介導的腸道組織損傷中具有一定作用[3]。Lnk可以調節樹突細胞的產生和功能。Lnk敲除小鼠的脾和淋巴結中樹突狀細胞(DCs)數目增加，與野生型小鼠相比,Lnk敲除鼠的DCs促進T細胞從幼稚的CD4+T細胞向產生γ干擾素(IFN-γ)的Th1細胞分化的能力明顯增強，產生IFN-γ的Th1細胞在細胞免疫中起重要作用，提示Lnk/SH2B3可以影響外周淋巴組織的細胞免疫應答反應[8]。除了以上免疫相關細胞外,Lnk對B淋巴細胞的生成過程也具有調節作用[9]。Lnk敲除小鼠脾臟中前B細胞和不成熟B細胞明顯增多，說明Lnk可負調節B細胞的產生[10]。Lnk通過抑制IL-7/JAK/STAT信號通路抑制前B細胞增殖和白血病發展[11]。

本研究觀察Lnk敲除后對小鼠結腸炎的影響，結果顯示,Lnk敲除小鼠結腸炎的癥狀更加嚴重，同時還發現Lnk敲除小鼠外周血中Breg數量顯著少于野生型小鼠。Breg是起負調節作用的B細胞亞群，可以抑制免疫反應，主要通過分泌白細胞介素-10(IL-10)行使其免疫負調控作用。研究[12]顯示Breg參與包括UC在內的很多免疫紊亂性疾病的發生、發展。臨床研究顯示,UC患者外周血中的Breg細胞數量顯著減少,IL-10產生明顯減少。在T細胞受體α敲除小鼠自發性結腸炎模型中,B細胞可以通過產生CD1d上調Breg細胞產生IL-10的水平，保護結腸免于炎癥損傷[13]。也有研究[14]顯示脾臟B細胞暴露于腸道菌群時，可獲得免疫抑制功能，通過IL-10依賴的途徑抑制T細胞介導的結腸炎。在DSS誘導的小鼠結腸炎模型中，B細胞缺乏可使結腸炎加重，給予B細胞可減輕結腸炎癥狀，而且給予不產生IL-10的B細胞同樣使結腸炎癥狀減輕，說明B細胞抑制腸道炎癥反應也可以通過非IL-10途徑實現[15]。

綜上所述,Lnk敲除小鼠表現為更加嚴重的結腸炎癥狀，提示Lnk對于結腸炎的發生具有抑制作用，其機制可能與Lnk對免疫細胞的調節有關。本研究發現Lnk敲除鼠外周血中Breg細胞顯著減少，而Lnk對于Breg細胞這一影響的具體機制還需要進一步研究探討。