自噬在機械通氣致大鼠腦組織神經元凋亡中的作用

余 鑫,米智華,高 巨

(揚州大學臨床醫學院 江蘇省蘇北人民醫院 麻醉科,江蘇 揚州,225001)

機械通氣是治療全身麻醉和急危重患者的重要輔助措施，臨床上全麻下高危手術后需要長時間機械通氣的患者數量日益增加[1]。然而，有研究[2-3]表明，長時間機械通氣可導致呼吸機相關性肺損傷(VILI)，甚至導致其他遠隔器官的損傷，如急性腦功能障礙[4]，其機制可能與誘發腦組織炎癥及神經元凋亡有關[5-6]。自噬廣泛存在于真核細胞中，它既是細胞的一種自我保護機制，同時也被認為是一種與凋亡、壞死并列的細胞程序性死亡機制[7-8]。研究[9]表明，自噬相關蛋白參與了大鼠呼吸機相關性肺損傷過程，但自噬對機械通氣致大鼠腦組織神經元凋亡的作用尚不清楚。本研究擬建立大鼠機械通氣致神經元凋亡模型，探討自噬在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康成年雄性Wister大鼠24只，體質量200～250 g,由揚州大學比較醫學中心提供。采用隨機數字表法將其分為4組:對照組(C組)、機械通氣組(MV組)、機械通氣+6-氨基-3-甲基嘌呤處理組(3MA組)、機械通氣+雷帕霉素處理組(R組)，每組6只。

1.2 方法

實驗前禁食10 h,自由飲水。腹腔注射0.7%水合氯醛5 mL/kg麻醉大鼠。參照文獻[10]的方法制備機械通氣致大鼠腦損傷模型。左側頸內靜脈穿刺置管用于泵注維庫溴銨維持肌松。頸部正中備皮、消毒，在距胸骨約1 cm處縱行剪開皮膚，鈍性分離皮下組織與肌肉，暴露氣管，切開并插管，固定。C組保留自主呼吸，不行機械通氣。MV組、3MA組及R組接DW 3000型小動物呼吸機(安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司)行機械通氣。呼氣末正壓(PEEP)為0時吸入空氣。呼吸參數設置:吸呼比1∶2、潮氣量40 mL/kg、通氣頻率40次/min、通氣時間6 h。3MA組及R組于MV前15 min分別腹腔注射自噬抑制劑3-MA 30 mg/kg及自噬激活劑雷帕霉素1 mg/kg,C組于MV前15 min腹腔注射等量生理鹽水。

機械通氣結束后立即于深麻醉下斷頭取腦，冰上快速分離海馬，取部分海馬組織,4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋，制備病理切片，常規蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察海馬CA1區神經元病理學改變。采用TUNEL染色法定量檢測凋亡細胞。石蠟切片脫蠟至水，加入濃度為20 pg/mL的蛋白酶K溶液消化，孵育15 min,PBS沖洗2 min(3次)，擦干組織周圍水分。加入TUNEL反應液混合液覆蓋樣本區，于濕盒中37 ℃反應1 h。PBS漂洗3 min(3次)，滴加POD,至濕盒內37℃孵育30 min,PBS沖洗5 min(3次)，滴加DAB溶液顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。凋亡神經元細胞核為深淺不一的棕黃色或棕褐色，非凋亡神經元細胞核呈藍色。200倍光學顯微鏡下觀察神經元形態;隨機選取每張切片的5個視野，計算細胞凋亡指數(AI)=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

取上述大鼠海馬組織,-80 ℃冰箱凍存。檢測時取海馬組織，加入蛋白裂解液，勻漿后4 ℃、12 000轉/min下離心15min,取上清液使用BCA法進行蛋白測定。取50 μg總蛋白上樣,SDS-PAGE電泳，電泳分離的蛋白轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,洗膜緩沖液(TBST)洗膜10 min,重復3次。加入一抗(抗Caspase-3、Bax/Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62抗體),4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min,重復3次;加入二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔)后室溫孵育1 h,TBST清洗，最后加入顯色底物顯色曝光，采用Image J圖像分析軟件測定各蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠腦組織病理學改變

C組海馬組織未見明顯的病理學改變，神經元排列緊密有序，神經元數量較多，胞體大小正常，形態規則，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯，染色質均勻;MV組神經元形態結構呈現明顯異常，層次紊亂，神經元數量減少、排列稀疏、間隙增大，胞核深染、固縮;與MV組相比,3MA組病理學損傷明顯減輕，正常神經元數量較多，神經元排列比較緊密，胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰，少見固縮變性的神經元;與MV組相比，R組病理學損傷進一步加重。見圖1。

a. C組

b. MV組

c. 3MA組

d. R組

圖1光鏡下觀察各組大鼠腦組織病理學改變

2.2 神經元凋亡指數、Bax/Bcl-2比值、活化型Caspase-3表達比較

與C組比較，其余3組組海馬神經元凋亡指數和Bax/Bcl-2比值升高，海馬活化型Caspase-3表達顯著上調(P<0.05);與MV組比較,3MA組大鼠的海馬神經元凋亡指數和Bax/Bcl-2比值下降，海馬活化型Caspase-3表達顯著下調(P<0.05);與MV組比較,R組大鼠的海馬神經元凋亡指數和Bax/Bcl-2比值升高，海馬活化型Caspase-3表達顯著上調(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠海馬神經元凋亡指數、Bax/Bcl-2比值、活化型Caspase-3表達比較

與C組比較,*P<0.05;與MV組比較,#P<0.05。

2.3 Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62表達比較

與C組比較，其余3組海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達上調,p62表達顯著下調(P<0.05);與MV組比較,3MA組大鼠海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達下調,p62表達顯著上調(P<0.05);與MV組比較,R組大鼠海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達上調,p62表達顯著下調(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/I比值、p62表達比較

與C組比較,*P<0.05;與MV組比較,#P<0.05。

3 討 論

機械通氣是治療危重患者和全麻患者的重要手段之一，但長時間機械通氣也可能會導致神經系統損傷，引起認知功能及記憶力的下降[11]。自噬是廣泛存在的細胞維持穩態的生理現象，適當激活的自噬可以阻礙疾病發展，但是過度激活的自噬也可能加重細胞損傷。因此，探討自噬在機械通氣致大鼠腦組織神經元凋亡中的作用具有重要意義。

本研究大鼠均采用水合氯醛麻醉，均衡了麻醉因素對海馬神經元凋亡的影響。參照文獻[10],采用大潮氣量長時間機械通氣法建立機械通氣致腦損傷模型。因為海馬是腦區中與記憶和學習練習最為密切，所以本研究采集大鼠海馬作為取材部位[12]。本研究結果顯示,6 h、40 mL/kg機械通氣下大鼠海馬組織出現明顯病理學改變，海馬神經元凋亡指數升高，提示本研究機械通氣致大鼠腦組織神經元凋亡模型制備成功。

Caspase是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族,Caspase-9在凋亡起始中具有重要作用，激活的Caspase-9可以激活細胞凋亡的最關鍵酶Caspase-3,從而促進后續的細胞凋亡信號[13]。Bcl-2是凋亡抑制因子,Bax是凋亡促進因子，常用Bax/Bcl-2的比值反映細胞凋亡情況[14-15]。本研究表明，與MV組相比,3MA組Bax/Bcl-2比值下降、海馬活化型Caspase-3表達下調,R組Bax/Bcl-2比值升高，海馬活化型Caspase-3表達上調，提示自噬抑制劑3-MA減輕了機械通氣導致的腦組織神經元凋亡程度，自噬誘導劑雷帕霉素加重了機械通氣致腦組織神經元凋亡程度。

Beclin-1是哺乳動物參與自噬泡形成的特異性基因，是自噬起始的重要調節因子,Beclin-1的表達水平可以反映自噬程度[16]。LC3是哺乳動物細胞中酵母ATG8基因的同源物，分為LC3Ⅰ型和LCⅡ型，自噬發生時LC3 Ⅰ經泛素樣加工修飾與磷脂酰乙醇胺結合，形成LC3 Ⅱ,LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值常用來反映自噬水平[17]。p62是機體內蛋白降解途徑的關鍵蛋白分子，其表達水平與自噬水平呈反比[18]。本研究結果表明，與C組比較,MV組海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達上調，p62表達下調。與MV組比較,3MA組大鼠海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達下調，p62表達上調,R組與之相反，提示機械通氣致大鼠腦組織神經元凋亡的機制與自噬有關。

綜上所述，長時間大潮氣量機械通氣致大鼠腦組織神經元凋亡的機制與自噬有關，但其具體機制仍有待進一步研究。