FOXF1在涎腺腺樣囊性癌中的表達及臨床意義研究

溫慶良 朱子羽 王澤凡 葛明華

腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是一種不常見的惡性腫瘤，其最具侵襲性的類型之一是涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）[1]。SACC約占所有唾液腺惡性腫瘤的21%～24%[2]。SACC患者預后不良、復發率高。研究發現，多種生物標志物可能與SACC的發生、發展和轉移密切相關[3-4]。例如，敲除SACC細胞株（SACC-83和SACC-LM）的癌基因Pim-1可抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，并通過細胞周期相關蛋白D1和CDK4引起細胞周期停滯和線粒體去極化，從而抑制SACC-83和SACC-LM細胞的侵襲能力[3]。另外，Pim-1和RUNX3基因表達水平還與ACC的T分期和神經侵犯有關[3]。而且，microRNA-21可通過靶向調控PDCD4-Stat3途徑促進SACC發生、發展[4]。叉頭蛋白1（forkhead box protein F1，FOXF1）是一個具有獨特叉頭結構域的轉錄因子，參與腫瘤的發生、發展[5]。FOXF1基因的特定功能尚不清楚，其可能參與調控胚胎發育過程，已證實FOXF1在肝臟、膽囊、氣管和肺的形成中起重要作用[5]。FOXF1具有致癌、抑癌的雙重作用，在不同的腫瘤中具有不同的作用[6-9]。基于此，本研究采用免疫組化染色法評估FOXF1在SACC組織中的表達，旨在分析其與患者臨床病理特征及預后的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2002年6月至2013年7月在浙江省腫瘤醫院行手術切除治療、術前未行放療或化療且術后組織病理學檢查確診為原發性SACC的患者93例。其中男37例，女56例；年齡24～78歲，中位年齡57歲；SACC組織類型：篩孔狀50例，導管狀26例，實體狀17例；T 分期：T1～3期 43 例，T4期 50 例。

1.2 方法

1.2.1 患者臨床特征與預后情況收集 回顧并記錄患者的臨床病理特征，包括是否首診、性別、年齡、腫瘤部位、TNM分期、是否遠處轉移、是否神經侵犯、是否淋巴結轉移、腫瘤組織類型等。統計患者的預后情況，定期對患者進行隨訪，以電話隨訪為主，若電話聯系3次無回應或住址所在派出所查無此人信息，視為失訪。本研究93例患者中11例失訪，3例患者非本病死亡。

1.2.2 SACC組織FOXF1表達檢測 采用免疫組化染色法進行半定量評估。取甲醛固定、石蠟包埋的SACC組織標本進行4μm厚連續切片，所有切片用二甲苯脫蠟并用乙醇脫水處理；采用0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液修復抗原，使用0.5%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶活性。切片在4℃環境下與抗FOXF1抗體孵育過夜，后于室溫下與二抗孵育（抗FOXF1抗體和二抗購自美國Abcam公司），然后應用DAB溶液顯現免疫反應性（DAB試劑盒購自北京中杉金橋公司），最后將切片進行脫水封片。2位病理科醫師獨立評估SACC組織FOXF1免疫組化染色結果，對于不一致的評估結果由第3位病理科醫師參與討論決定。染色結果包括陰性和陽性，具體評定標準[10]：染色強度評分分為 0、1、2、3 分，分別對應細胞無染色、淺黃色、黃棕色、棕色。染色范圍評分分為 0、1、2、3、4分，對應的染色細胞百分比分別為0%、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%。染色強度評分乘以染色范圍評分得到最終評分，最終評分＜5分定義為陰性，≥5分定義為陽性。

1.3 觀察指標 （1）觀察FOXF1在SACC組織中的表達情況；（2）分析SACC組織FOXF1表達與患者臨床病理特征的關系；（3）分析SACC患者復發的影響因素。復發的判斷標準：術后定期對原發部位和頸部（如也作過治療）行超聲和增強CT檢查，對肺部定期行胸部CT檢查，發現新的病灶或細針穿刺病理學檢查證實為SACC；（4）分析SACC組織FOXF1表達與患者無瘤生存的關系，無瘤生存是指患者從術后開始至疾病復發的時間。

1.4 統計學處理 應用SPSS 21.0統計軟件。計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；多因素分析采用Cox回歸模型；采用Kaplan-Meier法繪制無瘤生存曲線，兩組患者無瘤生存率的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FOXF1在SACC組織中的表達 46.2%（43/93）的患者SACC組織中FOXF1表達陽性，免疫組化染色結果顯示FOXF1表達于SACC細胞的細胞膜與細胞質（圖1）。

圖1 FOXF1在SACC組織中的表達（a:FOXF1表達陰性；b:FOXF1表達陽性；免疫組化染色，×200）

2.2 SACC組織FOXF1表達與患者臨床病理特征的關系 見表1。

由表1可見，腫瘤位于大涎腺的SACC患者FOXF1表達陽性率明顯高于腫瘤位于小涎腺的SACC患者（P＜0.05）。T1～3期 SACC 患者 FOXF1 表達陽性率明顯高于T4期患者（P＜0.05）。SACC組織FOXF1表達情況與患者是否首診、性別、年齡、遠處轉移、神經侵犯、淋巴結轉移和組織類型等病理特征無明顯關系（均P＞0.05）。

2.3 SACC患者復發的影響因素分析 本組患者隨訪3～145個月，中位隨訪時間49個月，其中復發患者39例。SACC患者復發的影響因素分析見表2。

由表2可見，單因素分析顯示年齡、T分期、FOXF1表達是SACC患者復發的影響因素（均P＜0.05）。對這3個因素進行多因素分析，結果顯示年齡、FOXF1表達是SACC患者復發的獨立影響因素（均P＜0.05）。

表1 SACC組織FOXF1表達與患者臨床病理特征的關系[例（%）]

表2 SACC患者復發的影響因素分析

2.4 SACC組織FOXF1表達情況與患者無瘤生存的關系分析 見圖2。

圖2 SACC組織FOXF1表達陽性與陰性患者無瘤生存曲線比較

由圖2可見，SACC組織FOXF1陽性表達患者與陰性表達患者的5年無瘤生存率分別為81.2%和50.9%，SACC組織FOXF1陽性表達患者5年無瘤生存率高于陰性表達患者（P＜0.05）。

3 討論

SACC好發于50～60歲的中老年人。目前，與SACC的發生、發展相關的明確危險因素尚不清楚。臨床對SACC的治療方法主要為根治性手術切除以及輔助放化療[1]。治療方法中影響SACC患者預后最重要的因素似乎是根治性手術切除的有效性，對放療和化療不敏感的SACC患者通常預后不良，易局部復發和遠處轉移[1]。為更有效地診斷和治療SACC，臨床應進一步探索與SACC發生、發展和轉移相關的新型生物標志物，從而為研發SACC靶向藥物提供思路。

FOX蛋白屬于進化上保守的DNA結合轉錄調節因子家族成員，其在許多生物學過程和腫瘤發生、發展中均起重要作用[11-12]。在肝細胞癌中，FOXF1低表達促進肝細胞癌的發生、發展和侵襲能力，并與患者不良預后有關[13]。此外，在淋巴結轉移的非小細胞肺癌中發現FOXF1明顯上調[14]。在乳腺癌中，FOXF1被認為是在表觀遺傳學上沉默的潛在的腫瘤抑制因子，其主要通過調節細胞周期來維持基因組穩定性[15]。本研究為分析FOXF1表達與SACC之間的關系，采用免疫組化染色法評估FOXF1在SACC組織中的表達情況。結果顯示，46.2%的SACC患者SACC組織中FOXF1表達陽性。T1～3期SACC患者FOXF1表達陽性率明顯高于T4期患者。SACC組織FOXF1表達陽性患者5年無瘤生存率高于陰性表達患者。這表明SACC組織中FOXF1表達陰性是一個不良的預后因素，FOXF1在SACC進展中起腫瘤抑制作用，SACC組織FOXF1表達陰性患者術后預后較差。由于FOXF1基因啟動子區域異常甲基化而在多種惡性腫瘤中表達下調或缺失[6，12，15]，因此筆者推測SACC組織中FOXF1表達陰性與其啟動子區域異常甲基化有關。

此外，FOXF1的表達與腫瘤部位有關，位于大涎腺的SACC較位于小涎腺的SACC具有更高的FOXF1表達陽性率，這表明位于小涎腺的SACC可能比位于大涎腺的SACC預后差。而SACC組織FOXF1表達與患者是否首診、性別、年齡、遠處轉移、神經侵犯、淋巴結轉移和組織類型等病理特征無明顯關系。這些結果表明FOXF1在SACC中可能通過下調的方式促進SACC的發生、發展，但具體機制尚不清楚。有研究發現，FOXF1通過抑制涉及CDK2-RB-E2F途徑的DNA復制而起到腫瘤抑制作用，在乳腺癌中FOXF1表達缺失與乳腺癌細胞FOXF1啟動子高甲基化有關[15]。Tamura等[8]報道FOXF1是p53家族的靶基因，FOXF1和p53形成調節轉錄網絡的一部分，FOXF1的異位表達可抑制癌細胞的侵襲和轉移，而FOXF1的失活能刺激細胞的侵襲和遷移。但也有研究指出FOXF1具有促癌作用[16-18]，FOXF1可通過轉錄激活SNAI1誘導上皮-間質轉化從而促進結直腸癌的轉移；FOXF1可通過刺激絲裂原活化蛋白激酶ERK5來促進前列腺癌的發生、發展；FOXF1可通過上調賴氨酰氧化酶和抑制Smad2/3信號傳導促進乳腺癌細胞的遷移。以上研究結果表明，FOXF1具有致癌和抑癌的雙重作用，在不同的腫瘤中發揮不同的作用。另本研究結果還顯示，年齡、FOXF1表達是SACC患者復發的獨立影響因素，這與Wen等[1]的研究結果相符。

綜上所述，本研究結果顯示，FOXF1的表達與SACC患者T分期和腫瘤部位有關。SACC組織FOXF1表達陰性預示患者預后不良。上調FOXF1的表達可能是改善SACC患者預后的新方法。FOXF1在SACC的發生、發展中起腫瘤抑制因子的作用，且可能是SACC預后較好的預測指標。