大腸癌組織中FAT4和YAP的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

吳麗娜 朱峰 徐鋮 葉恩如

大腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥類型之一，中國 每年有200萬新診斷病例。近年來，雖然在衛(wèi)生保健和篩查手段方面有所改進，但是大腸癌相關死亡的新病例數(shù)量卻在逐年增加[1-2]。大腸癌的高發(fā)病率和高死亡率提示，研究其發(fā)病機制對于改善大腸癌治療現(xiàn)狀具有重要的臨床意義。脂肪非典型鈣黏蛋白4（fat atypical cadherin，F(xiàn)AT4）屬于鈣黏蛋白超家族成員之一，作為跨膜蛋白受體可以將上游Hippo信號通路的細胞外信號傳導至細胞內(nèi)。研究證實FAT4對惡性腫瘤有抑制作用，F(xiàn)AT4基因失活可能與啟動子的甲基化有關[3]，外周血白細胞FAT4異常甲基化和基因-環(huán)境相互作用與胃癌的風險相關[4]。Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo信號通路的關鍵組成部分，在人體生長、發(fā)育、修復和體內(nèi)平衡中起重要作用[5-6]。越來越多的證據(jù)表明YAP在胃癌[7]、乳腺癌[8]等多種惡性腫瘤中高表達，并與腫瘤的進展有關。本研究采用免疫組化En Vision法檢測FAT4和YAP在大腸癌組織和癌旁正常組織中的表達情況，分析大腸癌組織中FAT4和YAP的表達及其與臨床病理特征和預后的關系，旨在探討FAT4和YAP的表達是否參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程及對預后的影響。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2012年1月至2014年12月在本院行手術切除的大腸癌標本80例，術后均經(jīng)病理明確診斷，術前均未接受放療、化療及生物治療。80例患者中男 45 例，女 35 例；年齡 31～79（61.46±10.25）歲；腫瘤直徑≥5.0cm 31例，＜5.0cm 49例；組織學分級：高中分化55例，低分化25例；浸潤深度：未侵及漿膜30例，侵及漿膜50例；淋巴結轉移36例，無轉移44例；參照2010年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會修訂的TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期48例。同時以癌旁（距腫瘤原發(fā)灶＞5cm）組織作對照，病理檢查證實均為正常大腸組織。

1.2 主要試劑 兔抗人FAT4多克隆抗體購自美國Novus Biologicals公司，鼠抗人YAP單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，En Vision通用試劑盒和DAB顯色劑均購自丹麥Dako公司。

1.3 檢測方法大腸癌組織和癌旁正常組織標本離體后立即用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。采用免疫組化En Vision法進行染色，嚴格按照說明書要求進行操作。高壓鍋及檸檬酸修復液（pH 6.0）抗原修復，正常山羊血清封閉30min，一抗4℃過夜，二抗孵育30min，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用已知陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 FAT4和YAP染色陽性信號為出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒，F(xiàn)AT4定位于細胞質(zhì)或細胞核，YAP定位于細胞核。選取5個以上高倍視野（×400），觀察并記錄每張切片的染色強度和面積，通過半定量積分法進行判定。染色強度：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞數(shù)百分比：陽性細胞數(shù)百分比≤5%為0分，6%～10%為1分，11%～50%為2分，＞50%為3分。細胞染色強度與陽性細胞百分比計分的乘積為每例的最終積分。＜2分為陰性，≥2分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以 表示；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman等級相關分析FAT4和YAP表達的相關性。采用Kaplan-Menier法計算生存率，以log-rank法比較組間生存率的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大腸癌組織和癌旁正常組織中FAT4和YAP的表達 FAT4陽性表現(xiàn)為細胞質(zhì)或細胞核出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒，YAP陽性表現(xiàn)為細胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒，見圖1。大腸癌組織中FAT4陽性表達率為32.50%（26/80），明顯低于癌旁正常組織的66.25%（53/80），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=18.227，P＜0.01）。大腸癌組織中YAP陽性表達率為61.25%（49/80），明顯高于癌旁正常組織的13.75%（11/80），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=38.506，P＜0.01）。

圖1 大腸癌組織和癌旁正常組織中FAT4和YAP的表達（a：FAT4在大腸癌組織中陽性表達；b：FAT4在癌旁正常組織中陽性表達；c：YAP在大腸癌組織中陽性表達；d：YAP在癌旁正常組織中陰性表達；En Vision染色，×400）

2.2 大腸癌組織中FAT4和YAP表達與臨床病理特征的關系 FAT4陽性表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期均有關（均P＜0.01），而與患者性別、年齡、腫瘤直徑和分化程度均無關（均P＞0.05）。YAP陽性表達與腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移均有關（均P＜0.01），而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度和TNM分期均無關（均P＞0.05），見表1。

表1 大腸癌組織中FAT4和YAP表達與臨床病理特征的關系

2.3 大腸癌組織中FAT4和YAP表達的相關性 經(jīng)Spearman等級相關分析，大腸癌組織中FAT4的表達和YAP 的表達呈負相關（r=-0.434，P＜0.01），見表 2。

表2 80例大腸癌組織中FAT4和YAP表達的相關性（例）

2.4 大腸癌組織中FAT4和YAP的表達與患者預后的關系 80例大腸癌患者均采用電話隨訪3年，存活48例，死亡32例。FAT4表達陽性者3年生存率為84.62%，明顯高于FAT4表達陰性者的48.15%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.720，P＜0.01）；YAP表達陽性者 3年生存率為44.89%，明顯低于YAP表達陰性者的83.87%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.020，P＜0.01）。

3 討論

許多發(fā)育基因參與細胞增殖和細胞凋亡的調(diào)控失衡。FAT基因家族是鈣黏蛋白超家族的成員，在果蠅發(fā)育過程中調(diào)控細胞增殖和細胞極性[9]。FAT家族包含F(xiàn)AT1、FAT2、FAT3和FAT4 4個成員。FAT4基因編碼超過5 000個氨基酸的巨大跨膜蛋白。該基因是Hippo信號通路的成員，在調(diào)節(jié)器官大小方面具有重要作用。該信號通路的下游部分可以誘導轉錄共激活因子[YAP/具有PDZ結合基序（TAZ）]調(diào)節(jié)細胞增殖，逃避細胞凋亡。此外，F(xiàn)AT4在多種腫瘤中低表達，是腫瘤的抑制基因[10-12]。與正常對照組織比較，胃腺癌組織中FAT4表達減少。FAT4表達下調(diào)與腫瘤分級有關，晚期分級中有較高的抑制作用。FAT4表達降低及其啟動子甲基化增加可能是將正常的胃組織轉變?yōu)槟[瘤組織的有效過程之一[13]。本研究顯示，大腸癌組織中FAT4陽性表達率明顯低于癌旁正常組織，且FAT4陽性表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期均有關。生存分析顯示，F(xiàn)AT4表達陽性者3年生存率明顯高于FAT4表達陰性者，提示FAT4表達陰性者預后差。表明FAT4蛋白表達下降可能在大腸癌的發(fā)生、浸潤及轉移過程中起作用，進一步提示FAT4是大腸癌的抑制基因，與上述研究結果類似。

YAP是Hippo信號通路的核心效應因子，在調(diào)控細胞增殖和凋亡及組織器官大小方面起著重要作用。YAP進入細胞核后作為轉錄共激活因子與TEA域家族成員1（TEAD1）結合，誘導靶基因表達，進而在調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡、上皮間質(zhì)轉化及癌變過程中起作用[14]。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌（HCC）組織中，YAP表達明顯增加，并且其過表達與腫瘤分化程度相關。通過小干擾RNA沉默YAP導致HCC細胞生長的抑制，這與促進細胞凋亡有關。YAP的沉默還降低了HCC細胞的侵襲潛力，增加了HCC細胞對順鉑的化學敏感性。總之，這些結果表明YAP在HCC中過表達，并促進HCC細胞的增殖、侵襲和耐藥性。本研究顯示，大腸癌組織中YAP陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，且YAP陽性表達與腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移均有關。生存分析顯示，YAP表達陽性者3年生存率明顯低于YAP表達陰性者，提示YAP表達陽性者預后差。

在胃癌細胞中采用短發(fā)夾狀RNA沉默F(xiàn)AT4，發(fā)現(xiàn)FAT4抑制導致YAP的磷酸化和YAP核積聚增加，這與促進細胞增殖、遷移和細胞周期進展相關。進一步將全長FAT4轉染到FAT4沉默細胞中，發(fā)現(xiàn)YAP磷酸化的減少和細胞周期進程的抑制[16]。表明胃癌組織FAT4表達下降，可以抑制YAP的磷酸化和促進YAP進入細胞核，導致YAP在細胞核中表達上調(diào)，進而參與胃癌的侵襲、轉移。FAT4和YAP在大腸癌的相互作用如何，目前還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中FAT4的表達和YAP的表達呈負相關，提示FAT4和YAP是一對拮抗因素，F(xiàn)AT4可能通過上調(diào)YAP的表達，參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展，這與上述胃癌中的研究結果一致。

綜上所述，大腸癌組織中FAT4表達降低，而YAP表達升高，其異常表達均與大腸癌的浸潤、轉移有關。FAT4的表達和YAP的表達呈負相關，F(xiàn)AT4表達陽性者較陰性者預后好，而YAP表達陽性者較陰性者預后差，兩者異常表達可能與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關。FAT4和YAP在大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中如何調(diào)控及調(diào)控的具體機制如何需要從細胞培養(yǎng)及體外實驗進一步闡明。