基于ISSR技術的茭白種質資源遺傳多樣性

王凌云，楊夢飛，李怡鵬，張尚法，鄭寨生

(金華市農業科學研究院 蔬菜研究所，浙江 金華 321000)

茭白(ZizanialatifoliaTurcz.)，古稱菰，為禾本科菰屬多年生宿根性水生草本植物，原產于中國和東南亞[1]。古代采食其籽粒，作為糧食作物栽培。后因菰黑粉菌(UstilagoesculentaP.Henn.)侵染，在適宜條件下，茭白植株莖尖數節畸形膨大形成肥嫩的肉質莖，為人們所食用[2-4]。茭肉白嫩細膩、營養豐富、味道鮮美，是我國僅次于蓮藕的第二大類水生蔬菜。除作為蔬菜食用之外，在中醫學上，茭白性味甘、涼、滑、無毒，有止渴、開胃、除目黃、利大小便、預防高血壓和動脈硬化等功效。

茭白因受黑粉菌侵染，不再開花結實而轉化為無性繁殖，因此在茭白的栽培和選育種過程中，都是采用分株、分蘗等無性繁殖的方法。經過長期的選育種和地區間相互引種，目前，我國茭白品種資源豐富且類型各異。通常根據茭白品種的外觀形態和農藝性狀定向篩選茭白新品種，茭農也常常根據自身需求對茭白品種進行篩選。此外，茭農在茭白種植過程中普遍就近引種和自行命名，導致茭白品種上同種異名和同名異種問題嚴重，茭白品種間的親緣關系比較復雜和混亂。上述問題對茭白產業的進一步發展產生了很大障礙，而形態鑒別很難確定品種或品系間的相互關系，因此在分子水平上明確茭白品種間的遺傳差異就顯得尤為重要。

目前分子標記已被廣泛應用于植物遺傳多樣性分析與種質鑒定等方面。ISSR(inter-simple sequence repeats)分子標記是一種利用重復序列加選擇性堿基為引物，對基因組DNA進行擴增的標記體系[5]，即用微衛星錨定引物退火至SSR區域，擴增出SSRs毗連區域，擴增產物經電泳分離獲得指紋圖譜，從而揭示樣本間的遺傳多樣性。ISSR分子標記為隨機引物，無需預先了解DNA序列，具有能夠顯示較高多態性、重復性高、易于操作、對基因組DNA的質量要求低等方面優點[6-8]。

本研究針對茭白種質資源和品種選育中存在的問題，應用ISSR技術對茭白品種的DNA多態性進行分析，以期從分子水平上探討茭白品種間遺傳背景的差異，為茭白種質資源與遺傳育種研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料為金華市農業科學研究院水生蔬菜資源圃保存的茭白品種和地方品系，共30份，具體為(1)金茭1號，(2)金茭2號，(3)嘉興茭，(4)象牙茭，(5)三口冷水茭，(6)一點紅，(7)美人茭，(8)天臺茭，(9)十月茭，(10)溫嶺茭，(11)老竹茭，(12)吳嶺茭，(13)湖州八月茭，(14)中秋茭，(15)浙茭2號，(16)龍茭2號，(17)浙茭3號，(18)嵊茭1號，(19)浙茭5號，(20)冬茭，(21)梭子茭，(22)黃巖雙季茭，(23)小蠟臺，(24)余杭茭，(25)浙茭911，(26)早茭，(27)白玉，(28)白種，(29)廣益茭，(30)曲靖單季茭。采集植物材料時，全部采集生長期的幼嫩葉片，試驗材料置超低溫冰箱中保存備用。TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA marker購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他常規試劑采用進口分裝或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與檢測

每個材料稱取新鮮幼葉50 mg，在-30 ℃預冷的研缽中用液氮迅速研磨成粉狀，裝入2 mL離心管中；在離心管中加入預熱至65 ℃的2×CTAB提取緩沖液800 μL，加60 μL巰基乙醇混勻，65 ℃溫浴30 min，其間混勻2～3次；取出樣品待冷卻至室溫后加入等體積的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)，振蕩混勻，12 000 r·min-1離心15 min；取上清液加入等體積的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)，振蕩混勻，12 000 r·min-1離心15 min；取上清液加入1.5倍體積1×CTAB沉淀液，放置20～30 min后，12 000 r·min-1離心15 min；將沉淀晾干后溶于200 μL TE，加入400 μL 95%乙醇、20 μL 3 mol·L-1NaAC，-20 ℃沉淀1 h，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，500 μL 75%乙醇洗滌，12 000 r·min-1離心10 min，加入30～50 μL TE溶解DNA，用質量分數0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量[9-11]。

1.2.2 ISSR引物

ISSR引物參照哥倫比亞大學UBC公布的96個ISSR引物序列，用提取的茭白DNA進行初步篩選。

1.2.3 PCR擴增

25 μL反應體系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，引物0.5 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.5 μL，無菌水19 μL。反應程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火(每一條引物都有相應的最佳退火溫度)45 s，72 ℃ 2 min，45個循環；72 ℃ 10 min。

1.3 數據統計與分析

按照電泳圖譜同一位置上ISSR條帶的有無進行統計，有條帶的記為1，無條帶的記為0，獲得原始0、1數據矩陣，應用非加權組平均法(UPGMA)對試驗材料進行聚類分析，建立聚類圖。

2 結果與分析

2.1 ISSR多態性

隨機挑取3個品種茭白的基因組DNA對合成的ISSR引物進行篩選，從中篩選出8個擴增帶型清晰、多態性適中的引物，用這8個引物對30份茭白材料進行多態性分析。擴增指紋圖譜如圖1～圖4所示。從圖片所顯示的擴增條帶上看，這些材料之間的差異并不大。每個引物可擴增出7～13條DNA譜帶，平均每個引物擴增9.63條DNA譜帶，8個引物共產生77條譜帶，其中31條具有多態性，多態性比率為40.26%。引物U840多態性條帶為5條，其余都只有2～4條；平均每個引物產生的多態性條帶的數目為3.5條，多態性百分率介于18.18%～41.66%。

圖1 引物U809和U810擴增結果

圖2 引物U811和U827擴增結果

圖3 引物U836和U840擴增結果

圖4 引物U886和U889擴增結果

2.2 遺傳相似系數和聚類

以30個茭白品種和77個位點的譜帶數據為原始矩陣，用NTSYS2pc Version 2.10計算，獲得了兩兩不同的品種間遺傳相似性系數。結果表明，30個茭白品種的遺傳相似系數GS為0.88～0.94。其中，遺傳相似系數最大的是浙茭5號和浙茭2號，達到0.94，說明它們之間的親緣關系較近，遺傳差異小；曲靖單季茭和老竹茭與其他品種遺傳差異較大，遺傳相似系數分別為0.880和0.897。利用ISSR標記數據計算品種間的遺傳相似性系數矩陣，采用UPGMA法構建了30份茭白品種間的遺傳關系聚類圖(圖5)，以0.916為閾值可以把剩下28個茭白品種分為3組。第一組分為2個次級亞類，分別是金茭1號、金茭2號等4個單季茭和余杭茭、浙茭911、早茭3個雙季茭，均是浙江本地品種和改良品種。第二組包括了浙江省近年來選育的大部分新品種，如龍茭2號、嵊茭1號、浙茭系列，同時包括了杭州地方資源和蘇州地方資源，如梭子茭、美人茭、象牙茭、八月白、小蠟臺等，它們具有較高的遺傳相似性。第三組同樣分為2個次級亞類，第一類天臺茭、溫嶺茭、黃巖雙季茭均來自浙江臺州，第二類白玉、白種、廣益茭全部來自江蘇蘇州，劃分較為清晰，它們也具有較高的遺傳相似性。

3 小結

品種間遺傳關系研究和遺傳多樣性分析對于作物育種具有十分重要的意義[12]。茭白常采用形態標記進行分類，但茭白是菰與黑粉菌共生的產物，形態特征受環境影響較大，鑒定比較困難。DNA指紋圖譜是遺傳物質直接、直觀的體現，不受生物體組織部位、生長周期、環境因素的影響。ISSR標記因其多態性高、穩定性強而得到肯定，在植物親緣關系與遺傳多樣性分析中應用廣泛。本實驗在樣品采集時選用幼嫩茭白葉片，排除了黑粉菌的干擾，因此實驗結果能夠準確反應茭白品種的遺傳基礎。

圖5 30個茭白品種的UPGMA聚類結果

茭白DNA的擴增圖譜差異不明顯，多態性分析得出30份茭白品種資源的多態性條帶百分率只有40.26%，可能在引物的篩選上還需改進。另一方面，供試材料的遺傳基礎狹窄，親緣關系比較接近，這與其他研究報道結果相似[13-14]，可能與供試材料主要來源于浙江、江蘇有關，兩地都是茭白的主要產區，地域位置近，長期以來品種資源交流密切，目前大面積推廣的品種都是基于兩地地方品種改良而來。遺傳相似度較高的茭白品種在栽培中表現出不同的外觀特征和農藝性狀可能是黑粉菌侵染過程中不同亞種作用引起的。