紫山藥組織培養快繁技術優化

韓曉勇，王立，殷劍美，張培通，郭文琦，李春宏

(江蘇省農業科學院 經濟作物研究所，江蘇 南京 210014)

紫山藥(Dioscoreaalata)是山藥(Dioscoreaopposita)中珍貴的精品，因其肉質、表皮紅中帶紫而得名，富含黏液質、多糖、蛋白質、淀粉和礦物質元素，特別是花色苷含量比較高。花色苷是迄今為止所發現的最強效的自由基清除劑，具有抗氧化衰老、抗突變、抗癌與抗動脈硬化等功能，作為保健食品或輔助治療藥物具有巨大潛力和應用前景[1]。紫山藥主要通過塊莖繁殖，塊莖繁殖用種量大，生產成本較高，易受季節限制，且長期利用塊莖繁殖易造成種性退化，抗病性和抗逆性減退[2]。紫山藥組培再生體系技術研究不僅有利于品種的更新復壯，獲得基因型、長相一致的優良種苗，還可為其種苗工廠化生產提供一定的技術支持。

韓曉勇等[3-4]以臺州市紫山藥帶腋芽的莖段為外植體，建立了臺州紫山藥組織培養快繁體系，并研究了培養基用量、植物生長調節劑濃度配比、蔗糖濃度，及光照強度對紫山藥試管薯形成和生長發育影響。王碧琴等[5-7]以紫山藥的莖尖、莖段為材料，對莖尖、莖段誘導分化不定芽進行初步研究，發現培養基中添加抗褐化劑活性炭(AC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，莖尖比莖段的培養效果好，能明顯降低培養基褐化速度，延長培養物培養時間；芽苗在白光源培養下的增殖系數是LED紅光的2.3倍，藍光和紫紅混光的1.6倍，生長速率是紅光和紫紅光的1.8倍，鮮質量是藍光和紫紅光的1.5倍，表明白光是紫山藥試管芽苗培養較為理想的光質。蔡月琴等[8]以紫山藥無菌苗為試材，研究了植物生長調節劑種類、材料類型、光暗條件等對愈傷組織誘導及其分化的影響。這些研究為紫山藥組培苗的培養奠定了一定基礎，但關于紫山藥莖段取樣部位、取樣時間、不同世代的繁殖系數和試管薯形成尚未見報道。筆者在前人研究的基礎上，進一步優化紫山藥組織培養技術，為紫山藥良種繁育、種質交換和種質資源保存等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以江蘇省農業科學院紫山藥品種蘇蕷1號為材料。紫山藥種植于小高壟上，出苗后備用。

1.2 處理設計

1.2.1 紫山藥不同部位的腋芽分化力

取長勢一致的紫山藥莖，去掉葉片和莖尖1～2節腋芽，將莖段從上到下依次取3節，作上、中、下部3個處理，用剪刀截成1.5～2.0 cm帶腋芽的莖段。滅菌后接種在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培養基中，接種7 d時統計各處理污染數、死亡數，計算污染率和死亡率；接種25 d后，比較各處理腋芽分化數，計算分化率。每個處理設3次重復，每次重復35個莖段。

1.2.2 紫山藥不同生長期的腋芽分化力

紫山藥出苗后，分別在07-29、08-12、08-28、09-11和09-26，取帶腋芽的莖段，滅菌后接種在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培養基中，去除污染莖段。接種25 d后，比較各處理腋芽分化數、總芽數和芽高，計算分化率和平均芽數。每個處理設3次重復，每次重復35個莖段。

1.2.3 紫山藥不同接種世代的組培增殖系數

將帶腋芽的莖段接種在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培養基，培養30 d，將高2.0 cm左右葉片切下，轉入生根培養基1/2 MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1+0.02%活性炭培養，連續培養3代，培養45 d。統計每1代的株高、成形葉數、不成形葉數(2 cm以下)和根數，計算有效增殖系數。每個接種世代設3次重復，每次重復10株組培苗。理論上每片葉均帶1個節，計理論增殖系數為1，實際上不成形葉并不能用作繼代，即有效增殖系數=成形葉數/(成形葉數+不成形葉數)。

1.2.4 不同接種世代對試管薯形成的影響

T1、T2和T3代的組培苗分別培養90 d后，每個世代隨機選取10株，調查結薯數、試管薯鮮質量、干質量，3次重復。每個世代隨機選取5個種薯，量取長度和周長，3次重復。

1.2.5 培養基滅菌及培養條件

高壓滅菌前用1 mol·L-1的KOH調整培養基pH值為5.8，保持121 ℃滅菌20 min。培養室溫度為(25±2)℃，光照強度2 000～2 500 lx，光照周期12 h·d-1。培養基中瓊脂質量分數為7 g·L-1，蔗糖的質量分數為30 g·L-1。

1.3 數據分析

用Excel 2003和STAT統計軟件分析試驗數據。

2 結果與分析

2.1 不同部位對紫山藥腋芽分化力的影響

在上、中和下部莖段芽數差異不顯著的情況下，紫山藥植株不同取樣部位的腋芽分化力不同。其中，中部莖段發芽數最多，為19.3個；下部的發芽率最高，為76.7%；上部莖段發芽數和發芽率最低，分別為13.3和51.7%。上、中和下部莖段的污染數和污染率無顯著差異，但上部莖段死亡數和死亡率顯著高于中、下部。

表1 不同部位對紫山藥腋芽分化力的影響

注：同列無相同小寫字母表示組間差異達0.05水平。

2.2 不同生長期對紫山藥腋芽分化力的影響

從表2可以看出，紫山藥不同生長期，腋芽分化力不同。其中，8月28日取樣的莖段，發芽數、總芽數和發芽率顯著高于其他取樣時間，分別為22.3、39.3和88.1%。隨著山藥生長期的推進，莖段腋芽分化率呈先升后降的趨勢。7月29日取樣的莖段發芽數、總芽數、發芽率和平均芽數均最低，分別為9.7、10.3、37.6%和1.1。不同生長期取樣的莖段芽高差異不大，8月12日取樣的莖段芽高最低，為1.4 cm，顯著低于其他時期。

表2 不同生長期對紫山藥腋芽分化力的影響

2.3 不同接種世代對紫山藥組培增殖系數的影響

從表3可以看出，接種T2代組培苗株高、有效增殖系數顯著高于T1和T3代，分別為5.5 cm和9.5。T1代成形葉數最多，為10.2，但不成形葉數也最多，從而影響有效增殖系數。T3代成形葉數等于有效增殖系數，為4.9。T2代之后，隨著接種世代的增加，組培苗株高、成形葉數、不成形葉數、根數和有效增殖系數均呈下降趨勢。

表3 不同接種世代對紫山藥組培增殖系數的影響

2.4 不同接種世代對試管薯形成的影響

從表4可以看出，接種T3代試管薯鮮質量、干質量、薯長和周長顯著高于T1和T2代，單株結薯數顯著高于T1代。T1和T2代試管薯產量構成無顯著差異。

表4 不同接種世代對試管薯產量構成的影響

3 小結

紫山藥植株不同取樣部位的腋芽分化力不同。中下部莖段發芽數和發芽率顯著高于上部莖段，因此，紫山藥組培宜取植株中下部莖段，尤其是中部莖段。通常認為，上部莖段較嫩，細胞分裂旺盛，易分化不定芽[9-10]；但相同滅菌時間不僅會顯著增加上部莖段死亡數和死亡率，而且易對莖段造成傷害，從而影響發芽率。紫山藥不同生長發育期，腋芽分化力不同。其中，8月28日取樣的莖段，發芽數、總芽數和發芽率顯著高于其他取樣時間，這可能是由于8月28日處于藤蔓快速生長期、腋芽分化力強所致。隨著紫山藥生長期的推進，莖段腋芽分化率呈先升后降的趨勢，這與植株地上部分生長趨勢基本一致。

不同接種世代，紫山藥組培增殖系數不同，接種T1和T2代組培苗株高、有效增殖系數顯著高于T3代。隨著接種世代的增加，組培苗株高、成形葉數、根數和有效增殖系數均呈下降趨勢。可能是繼代培養過程中組培苗內源生長素水平提高，直接抑制了苗的分化，也可能是多次繼代后細胞自身退化，導致分化能力下降。此外，在培養過程中，細胞的核型可能發生變異，染色體出現高度的非整倍性，也會使細胞的形態發生能力下降甚至喪失[11]。接種T3代試管薯鮮質量、干質量、種薯長和周長顯著高于T1和T2代，這可能是由于T1和T2代組培苗株高、成形葉數和不成形葉數顯著高于T3，造成試管苗營養生長旺盛，影響營養物質向塊莖分配和累積，進而減少試管薯的質量。