二甲雙胍治療坐骨神經結扎誘發大鼠神經病理性疼痛的效應

王之遙， 李瑋珊， 李艾倫， 方 芳， 倉 靜

復旦大學附屬中山醫院麻醉科，上海 230032

神經病理性疼痛是由各種原因導致的以神經病理性改變為主的頑固性疼痛，主要表現為痛覺過敏、疼痛異常。其發病機制較為復雜，是疼痛治療的難點之一。目前臨床上常用的治療藥物包括抗抑郁藥、抗癲癇藥、阿片類鎮痛藥、局麻藥以及非甾體類抗炎藥等，治療效果均不理想[1]。二甲雙胍作為臨床上2型糖尿病治療的一線用藥，可達到良好的降糖效果且不良反應少。近年來，二甲雙胍降糖以外的作用越來越被重視。已有研究[2-6]發現，二甲雙胍具有抗炎、抗腫瘤以及調節脂質代謝等作用。臨床研究[7-8]表明，二甲雙胍作為輔助用藥聯合加巴噴丁和曲馬多對神經病理性疼痛患者安全有效，但相關報道有限。本研究擬評價二甲雙胍治療單側坐骨神經神經慢性壓迫損傷(chronic constriction injury，CCI)誘發的大鼠神經病理性疼痛的效應，為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 輻射熱測試儀購自美國IITC Life Science公司，Von Frey纖毛購自美國Stoelting公司，CatWalk步態分析系統購自荷蘭Noldus公司。戊巴比妥鈉、二甲雙胍購自美國Sigma公司。丙酮溶液(純度>99.5%)購于國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.2 動物分組及模型制備

1.2.1 動物來源及飼養 SPF級雌性SD大鼠初始體質量180～200 g，7～9 周齡，由復旦大學上海醫學院動物實驗中心提供，以5只/籠飼養。所有動物可在籠內自由活動、攝食和飲水。保持飼養環境溫度為23℃及相對恒定濕度；12 h晝夜循環光照并定期更換墊料。所有動物在實施手術以及行為實驗時均嚴格遵守國際疼痛研究學會(IASP)的相關標準。采用隨機數字表法，將其分為4組(n=12)：正常對照組(Naive組)、假手術組(Sham組)、CCI組和CCI+二甲雙胍組(Met組)。

1.2.2 神經病理性疼痛模型的建立及給藥方法 根據Bennet和Xie[9]的方法建立坐骨神經CCI模型。將大鼠稱質量后，將4%戊巴比妥按0.2 mL/100 g的劑量進行腹腔注射麻醉。大鼠采取側臥位，備皮并用乙醇消毒術區。在左側股骨下方約1 cm平行于股骨切開皮膚，鈍性分離肌肉暴露坐骨神經；在神經三支分叉以上的位置用4-0含鉻羊腸線結扎坐骨神經4道，每道間隔約1 mm，保證結扎神經的長度為4～5 mm，結扎的松緊度以見周圍肌肉輕微抽動為佳；逐層縫合肌肉層以及皮膚；最后再次消毒手術區域。Sham組僅暴露而不結扎坐骨神經，其他組手術操作與CCI組相同。造模手術由同一人操作，以保證手術效果的均一性。Met組采用灌胃方式給藥，每次劑量45 mg/kg，從CCI建模前3 d開始給藥，每天上午 8：00至9：00和下午的6：00至7：00，持續至術后第7天。

1.3 疼痛行為學觀察 分別于建模前(基線，D0)，建模后第3、7、10、14天觀察并記錄大鼠傷口愈合情況及舔咬肢體、疼痛相關行為。根據文獻[10]采用Von Frey法測定機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)： 在安靜舒適環境中將大鼠單獨放置于帶金屬網底(孔徑0.5 cm×0.5 cm)的透明有機玻璃籠內，適應30 min后用不同標號的Von Frey絲(美國Stoeling公司)垂直刺激術側后足足底部，將Von Frey絲彎曲至約45°并持續3～5 s。記錄產生快速縮足、抬足、抖動或舔舐反應時對應的Von Frey絲標號。每種標號的Von Frey絲均被測定至少出現3次陽性反應或3次無反應，每次刺激均間隔至少10 s。逐漸增加刺激強度至同一標號Von Frey絲出現至少3次陽性反應，記錄此時所用的Von Frey絲的標號作為MWT。

1.4 熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)的測定 在安靜舒適環境中將大鼠單獨放置于透明有機玻璃籠內，適應30 min后用熱輻射疼痛刺激儀照射大鼠術側后足足底，在照射20 s內當產生快速縮足、揚足或舔足反應時立即停止照射，并記錄下此時照射的持續時間。重復測量5次，每次間隔至少5 min，將5次的持續照射時間取平均值作為TWL。

1.5 冷刺激誘發縮足次數 (number of cold-stimulated paw withdrawal，TNCW)的測定 根據文獻[11]采用丙酮冷刺激法，在安靜舒適環境中將大鼠單獨放置于帶金屬網底(孔徑0.5 cm×0.5 cm)的透明有機玻璃籠內，適應30 min后用0.1 mL丙酮測定大鼠的疼痛反應閾值。測定方法：用0.1 mL丙酮刺激術側后足足底部，記錄2 min內大鼠所測后足的陽性反應次數。陽性反應為后足抬起、甩腿或舔足、拭足。測試3次，測試間隔時間至少5 min，將平均3次的陽性反應次數作為TNCW。

1.6 CatWalk步態測定 采用CatWalk步態分析系統對各組大鼠進行運動步態測定。大鼠在測試前預先放在測試環境中30 min，溫度控制在23℃左右，室內開紅色光并保持安靜。調整攝像頭保證每次都能采集到至少4個站立時間。測試時，將大鼠放在CatWalk通道的一端，通道寬度設置為大鼠身寬的1.5倍，使大鼠自行走過，選取20 cm的距離進行記錄，把通過時間控制在1～2 s。當大鼠的腳掌與玻璃平板的表面接觸時，下方攝像頭即可捕捉到腳印圖像并傳送到計算機，通過相應程序(Cat Walk XT 10.0)進行分析。每只大鼠至少重復測試3次。合格的測試需滿足以下條件：腳印數≥10個，動物總行走時間控制在1～8 s，速度方差小于60 cm/s。

足印面積指在站立時相腳掌接觸平板的總面積，與完整足印的平均強度均可反映行走時肢體的承重情況。而站立時間和擺動時間與受累側肢體的疼痛和動物的保護性行為相關。站立時間指大鼠腳掌每次接觸底板的時間。擺動時間指大鼠腳掌2次接觸平板的間隔時間。另外記錄步周長。

2 結 果

2.1 大鼠建模情況 各組大鼠術后皮膚切口愈合良好，未發生舔咬肢體現象。大鼠CCI建模后3 d逐漸出現術側足趾并攏輕度外翻，后肢行走無力，呈跛行步態。結果(表1)表明：與Naive組相比，CCI組和Met組大鼠在建模后3 ～14 d左足MWT顯著降低(P<0.05)，Sham組左足MWT無明顯改變；與CCI組相比，Met組大鼠3～14 d左足MWT明顯升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠左足機械縮足反射閾值 m/g

*P<0.05與Naive組比；△P<0.05與CCI組相比；▲P<0.05與D0相比

2.2 各組大鼠左足TWL的對比 結果(表2)表明：與Naive組相比，CCI組和Met組大鼠在建模后3～14 d左足TWL縮短(P<0.05)，Sham組TWL未見明顯改變；與CCI組相比，Met組大鼠3～14 d左足TWL明顯延長(P<0.05)。

表2 各組大鼠左足熱縮足反射潛伏期 t/s

*P<0.05與Naive組比；△P<0.05與CCI組相比；▲P<0.05與D0相比

2.3 各組大鼠左足TNCW的對比 結果(表3)表明：與Naive組相比，CCI組和Met組大鼠在建模后3～14 d左足TNCW減少(P<0.05)，Sham組TNCW未見明顯改變；與CCI組相比，Met組大鼠3～14 d左足TNCW明顯增加(P<0.05)。

表3 各組大鼠左足冷刺激誘發縮足次數 f/次

*P<0.05與Naive組比；△P<0.05與CCI組相比；▲P<0.05與D0相比

2.4 各組大鼠左側足印面積、完整足印的平均強度、站立時間及步周長的對比 結果(表4)表明：與Naive相比，CCI組大鼠左側足印面積縮小、完整足印的平均強度減弱、站立時間縮短、步周長減小、擺動時間延長，并持續至建模后第14 天(P<0.05)；Met組大鼠左側足印面積縮小、完整足印的平均強度減弱。與CCI組相比，Met組大鼠左側足印面積增加、完整足印的平均強度增強、站立時間延長及步周長增加(P<0.05)，擺動時間無明顯改變。Sham組上述指標在造模前后的各時間點均與對照組差異無統計意義。

表4 各組大鼠左側足印面積、完整足印的平均強度、站立時間、步周長等的對比

*P<0.05與Naive組比；△P<0.05與CCI組相比；▲P<0.05與D0相比

3 討 論

坐骨神經CCI大鼠模型是最經典的神經病理性疼痛動物模型。該模型的優點在于與神經病理性疼痛患者的臨床表現接近，并且為選擇性的較粗的有髓鞘的神經纖維損傷，而參與痛覺傳遞C纖維保留[9]。軸突損傷的異位放電和神經結扎的炎性反應共同導致疼痛的產生。此外，由于低齡和低體質量的雌性大鼠對于傷害性刺激更為敏感[12-13]，故本研究選擇7～9周齡、體質量180～200 g的雌性大鼠作為研究對象。行為學的結果發現，與Naive組相比，CCI組大鼠在建模后3 d左足MWT降低、TWL縮短、TNCW減少，而Sham組大鼠各指標無明顯改變，提示大鼠CCI模型建立成功。

除機械和冷熱觸發痛之外，本研究還進一步分析了CCI模型大鼠的步態變化。已有文獻[14-15]報道，CatWalk步態分析中的足印面積以及完整足印的平均強度等參數與Von Frey法檢測結果明顯相關，說明其可作為一種更為客觀的方法評估疼痛行為，避免了Von Frey方法的主觀影響。本研究結果證實CCI組大鼠左側足印面積縮小、完整足印的平均強度減弱及站立時間縮短，而擺動時間延長。另外，本研究還發現，CCI組大鼠的步周長減小以及站立時間縮短，說明造模后大鼠會由于患側后肢疼痛而減少該側肢體承重以及與地板接觸的時間，并且行走時步伐會縮短。

既往研究[16]顯示，磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)作為控制能量代謝的重要內源性激酶在痛覺調節中發揮至關重要的作用，其經典的激動劑包括白藜蘆醇、二甲雙胍等。Inyang等[17]利用成年雄性BALB/c小鼠建立SNI神經病理性疼痛小鼠模型，予以腹腔注射二甲雙胍，結果發現，二甲雙胍治療后的神經病理性疼痛小鼠術側機械痛閾比給藥前明顯升高，提示二甲雙胍能減輕SNI神經病理性疼痛雄性小鼠的痛覺。葛安琪等[18]發現，腹腔注射二甲雙胍可明顯逆轉骨癌痛大鼠的機械痛閾；二甲雙胍治療后，大鼠脊髓背角p-STAT3的表達顯著降低。Lu等[19]發現，在損傷神經的周圍局部注射AMPK激動劑也可升高神經病理性疼痛大鼠的MWT，其治療作用可能與巨噬細胞釋放內啡肽有關。然而，上述研究均僅對神經病理性疼痛大鼠的機械痛閾進行評估，方法較為單一。

本研究神經病理性疼痛大鼠采取二甲雙胍灌胃的方法(模擬臨床常用的給藥方式)來進行疼痛干預，并且對神經病理性疼痛大鼠進行行為學評估。結果表明，二甲雙胍可緩解CCI誘發神經病理性疼痛大鼠機械痛覺過敏，與既往研究結果相仿。此外，本研究結果還發現，二甲雙胍同樣可以改善CCI大鼠的冷熱痛覺過敏及步態，說明二甲雙胍可對不同種類的痛覺神經通路產生抑制效應。該效應的機制可能為：一方面，二甲雙胍可通過激活中樞神經細胞(小膠質細胞、星型膠質細胞)AMPK通路，抑制白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6等促炎介質釋放，進而產生中樞性鎮痛效應；另一方面，二甲雙胍通過抑制細胞外調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)活性，降低電壓門控通道Nav1.7的磷酸化水平，減少損傷后外周神經的異位放電，進而減輕疼痛[20]。然而，二甲雙胍調控神經病理性疼痛的具體機制及是否在神經免疫方面產生影響，仍需進一步證實。