槐耳清膏能抑制裸鼠肺癌細胞的增殖活性

童 琳， 常美佳， 胡 潔， 周 建， 白春學

復旦大學附屬中山醫院呼吸科，上海市呼吸病研究所，上海 200032

近年來，隨著對肺癌發病機制研究的進一步深入，新興的治療手段不斷涌現，使得晚期肺癌患者的預后得到較大改善。然而，老年晚期肺癌患者常無法耐受放化療、靶向等治療引起的不良反應。因此，應用不良反應小而有良好免疫增強和抗腫瘤作用的藥物是晚期肺癌治療的理想手段。

槐耳是生長在中國古槐樹上的一種天然菌，1 500余年前已作為藥物治療多種疾病。槐耳清膏是槐耳菌質的提取物，具有誘導腫瘤細胞分化和凋亡、逆轉腫瘤細胞耐藥性、提高免疫細胞殺傷能力、抑制腫瘤細胞遷移和侵襲能力等多靶位抗腫瘤功效[1]。體外研究[2]發現，槐耳清膏能誘導人肺腺癌細胞凋亡，逆轉肺腺癌細胞對順鉑的耐藥性，增強順鉑的化療作用。本研究通過探討槐耳清膏對裸鼠肺癌移植瘤的抑瘤作用，分析其對肺癌的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材 料 槐耳清膏制劑由啟東蓋天力藥業有限公司提供。將槐耳清膏溶于0.9% NaCl溶液，分別制成100、300、500、700 mg/mL的含藥溶液，用于槐耳清膏組裸鼠灌胃。SPF級裸鼠由復旦大學附屬中山醫院中心實驗室提供，雄性25只，鼠齡4～6周。

1.2 動物實驗 將PC9R肺癌細胞等量(1×107)接種到25只裸鼠皮下，待接種14 d接種部位腫瘤長出后，將其隨機分為5組，每組5只(實驗過程中有裸鼠死亡情況，因此實驗終點取瘤體時每組裸鼠為4～5只)。第1組每3 d給予槐耳清膏1 g/kg；第2組每3 d給予槐耳清膏3 g/kg；第3組每3 d給予槐耳清膏5 g/kg；第4組每3 d給予槐耳清膏7 g/kg；對照組每3 d給予0.9% NaCl溶液0.2 mL。接種前、接種14 d后以及給藥期間每周稱裸鼠體質量。喂養3周后頸椎脫臼處死，完整取出瘤體，比較各組瘤重和瘤體積，計算抑瘤率。抑瘤率的計算方法如下：用游標卡尺測量腫瘤最長徑(a)和最短徑(b)，腫瘤體積V=ab2/2；腫瘤相對體積(RTV)=某時間點腫瘤體積/分組時腫瘤體積；抑瘤率=(1-RTV槐耳清膏組/RTV對照組)×100%。

1.3 組織病理學檢查 腫瘤組織進行常規石蠟包埋切片，切片厚5 μm，進行常規蘇木精-伊紅(H-E)染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理學改變。腫瘤組織經Ki-67(DAKO公司提供)免疫組化染色，計算腫瘤組織Ki-67陽性細胞比率。

2 結 果

2.1 槐耳清膏對裸鼠皮下接種肺癌細胞成瘤的影響 25只裸鼠在接種PC9R肺癌細胞14 d后，接種部位均長出腫瘤，其他部位和器官均未見腫瘤生長。對腫瘤生長的抑制作用以槐耳清膏5 g/ kg和7 g/kg劑量組的作用較強，槐耳清膏3 g/kg組和1 g/kg組較弱。其中，5 g/kg體質量(P=0.004 4)和7 g/kg劑量組(P=0.021 5)抑瘤率與對照組差異有統計學意義(表1)；槐耳清膏7 g/kg組與5 g/kg組抑瘤率差異無統計學意義。喂養3周后取出移植瘤，稱重，顯示槐耳清膏5 g/kg組瘤重較對照組降低，但差異無統計學意義(圖1)。

表1 槐耳清膏對裸鼠肺癌的抑瘤率

**P<0.01，*P<0.05與對照組相比

圖1 槐耳清膏對裸鼠肺癌移植瘤質量的影響

2.2 槐耳清膏對皮下接種肺癌裸鼠體質量的影響 分別于種瘤前、種瘤后14 d、喂養期間每周稱裸鼠體質量，結果(圖2)顯示：對照組裸鼠體質量在喂養前2周逐步增長，在喂養第3周較前有所減輕；槐耳清膏3 g/kg、5 g/kg和7 g/kg組裸鼠體質量在喂養第3周仍呈增長趨勢，但差異無統計學意義。

圖2 槐耳清膏對肺癌移植瘤裸鼠體質量的影響

1：種瘤前；2：種瘤后14 d；3：給藥1周后；4：給藥2周后；5：給藥3周后

2.3 槐耳清膏對裸鼠皮下接種肺癌細胞的組織病理學影響 H-E染色結果(圖3)顯示：對照組腫瘤細胞生長旺盛，有異型性，形態不規則，大小不等，細胞核大、濃染，可見病理性核分裂相，無明顯壞死區。槐耳清膏組腫瘤細胞出現不同程度退行性變，局部出現缺血壞死區，壞死灶周圍可見殘存腫瘤細胞。

圖3 槐耳清膏對裸鼠肺癌腫瘤組織病理的影響(H-E染色)

A：對照組；B：槐耳清膏5 g/kg組. Original magnification: ×200

2.4 槐耳清膏對裸鼠皮下接種肺癌細胞的增殖指數影響 對肺癌移植瘤組織進行Ki-67免疫組化染色，結果(圖4)顯示：槐耳清膏3、5、7 g/kg組腫瘤細胞Ki-67陽性率均較對照組下降，其中7 g/kg組Ki-67陽性率最低(24.8%，P<0.001)，提示槐耳清膏對腫瘤細胞增殖活性有明顯抑制作用。

圖4 槐耳清膏對裸鼠肺癌腫瘤細胞Ki-67陽性率的影響

1：對照組；2：槐耳清膏1 g/kg；3：槐耳清膏3 g/kg；4：槐耳清膏5 g/kg；5：槐耳清膏7 g/kg. Original magnification: ×200.**P<0.01，*P<0.05與對照組相比

3 討 論

肺癌已成為全球癌癥相關死亡的首要病因，其死亡率占惡性腫瘤死亡率的第1位。目前肺癌的治療采用以外科手術為主的綜合療法，但有一半以上的肺癌患者確診時已是晚期，失去手術機會，可供選擇的方案為化療、放療、靶向治療、免疫治療等的綜合治療，但總體預后仍欠佳，并且治療的不良反應較大，較多患者無法耐受。因此，尋找對肺癌治療有效而人體不良反應小的藥物，一直是肺癌治療的研究熱點。槐耳清膏是槐耳菌質經熱水提取物，含有多種有機成分，10余種礦物質元素。槐耳多糖蛋白是槐耳清膏的主要活性成分，由6個單糖結合18種氨基酸組成，是一種活性很高的生物反應調節劑。槐耳清膏具有誘導腫瘤細胞分化和凋亡，提高免疫細胞殺傷能力，抑制腫瘤細胞遷移、侵襲能力等多重抗腫瘤功效[1]。槐耳清膏對正常細胞幾乎沒有損害。目前槐耳清膏已被制成槐耳顆粒應用于臨床，對肺癌、結腸癌、肝癌、食管癌等腫瘤都有明顯療效[1]。小樣本的臨床研究[3-5]發現，槐耳能延長晚期肺癌患者的生存期，改善其生活質量和免疫功能。

既往研究[6]顯示，槐耳對體外培養的人大細胞肺癌L9981具有劑量依賴性的生長抑制作用，其機制可能與調控血管生成相關基因表達有關。槐耳處理后的肺癌A549細胞miRNA基因芯片檢測結果顯示，有66個miRNA異常表達，其中miR-26b-5p上調可抑制肺癌細胞A549增殖，誘導其凋亡，而特異性的抑制劑可逆轉槐耳的作用。進一步機制研究發現，槐耳可能通過調控miR-26b-5p的作用靶點EZH2起到抗腫瘤作用；EZH2可上調wnt/β-catenin信號通路，進而上調β-catenin的表達，而β-catenin能夠上調Bcl-2的表達[7-9]。此外，槐耳多糖蛋白對非小細胞肺癌患者Th1/Th2細胞的免疫反應狀態具有調節作用[10]。

槐耳對肺癌的治療作用研究目前主要集中在體外細胞實驗，尚無動物體內研究進一步證實其療效。本研究通過建立裸鼠肺癌移植瘤模型，觀察槐耳清膏對肺癌細胞體內成瘤的影響，發現槐耳清膏對裸鼠移植瘤肺癌細胞具有顯著的抑瘤作用，其中5 g/kg和7 g/kg劑量下抑瘤率較高。Ki-67染色顯示，槐耳清膏組腫瘤細胞增殖活性明顯降低，提示槐耳對肺癌細胞的增殖具有抑制作用。此外，與對照組相比，槐耳清膏組裸鼠體質量逐步增長，提示槐耳對裸鼠的進食消化吸收等胃腸道功能無明顯影響，其抑制腫瘤生長的作用可逆轉腫瘤生長引起的裸鼠體質量減小。槐耳清膏具有不良反應少、耐藥性低、費用較其他治療手段少的特點，為肺癌治療的研究提供了新方向，但其具體作用機制有待進一步研究[11]。

本文全體作者聲明：本研究由國家自然科學基金(81490533, 81400018, 81570028, 81770039)，復旦大學附屬中山醫院臨床研究專項基金(2016ZSLC05)，北京醫衛健康公益基金會醫學科學研究基金(F2037E-中山醫院)支持，不受任何其他第3方的資金贊助，本研究結果無任何相關利益沖突。