實時熒光定量 PCR 在皮膚結核診斷中的應用

滿春花 糜自豪 孫樂樂 盧憲梅 王 川 王建文陳學超 劉永霞 陳聲利 劉 紅 張福仁1，

皮膚結核(Cutaneous tuberculosis, CTB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種慢性感染性疾病，占皮膚科門診量的0.034%～0.26%[1-5]，占結核病的比例小于1%～2%[6,7]。CTB臨床表現多樣[8]，診斷困難。CTB組織病理可呈現結核性肉芽腫，伴干酪樣壞死，有利于診斷，但由于機體免疫力強弱不同，干酪樣壞死可缺乏，甚至呈非特異性炎癥反應[9,10]，因此CTB確診往往還需依賴于抗酸染色、細菌培養、PCR等病原學方法。抗酸染色敏感性在0～13.8%[11,12],且無法與其它分枝桿菌相鑒別[13]；細菌培養可進行菌種鑒定，敏感性相應提高[12,14]，但耗時長，需9.5～17.3天[15-17]；隨著分子生物學方法的發展，基于MTB片段擴增的PCR技術成為CTB診斷的有力工具，但普通PCR技術易受污染DNA的影響而出現假陽性[18]，在臨床應用受限。實時熒光定量 PCR (Real time fluorescence quantitative PCR, qPCR)在結核中特異性達100%，敏感性達85%[19]，近年來越來越多的應用于結核的診斷中。該技術應用于CTB新鮮組織MTB的檢測中敏感性為24.5%～33.3%[12,14]。但CTB患者初診時往往會因臨床表現不典型，未留取新鮮組織用于qPCR檢測，而二次取材患者依從性差、亦增加患者負擔，既往研究已經證實qPCR可應用于系統結核石蠟包埋組織病原菌的檢測，敏感性為74.6%[20]。本文擬采用qPCR技術檢測CTB石蠟包埋組織及新鮮組織中的MTB，并初步比較在兩種組織中檢測的敏感性，以探討在CTB石蠟包埋組織中開展MTB檢測的可行性。

1 對象和方法

1.1 研究對象

1.1.1 新鮮組織樣本 2017年8月至2018年3月山東省皮膚病醫院病理科確診為CTB的新鮮組織樣本。所有參與研究的患者均簽署了知情同意書。

1.1.2 石蠟包埋組織樣本 山東省皮膚病醫院病理科2012年1月至2018年3月確診為CTB的石蠟包埋組織樣本。

1.1.3 確診標準 所有確診樣本除臨床和病理符合《中國臨床皮膚病學》CTB診斷外[21]，還必須滿足下列條件一條以上且抗結核治療有效方可入組：有現癥其它臟器結核；PPD試驗陽性或強陽性；T-SPOT.TB陽性[22]。

1.2 DNA的提取

1.2.1 新鮮組織DNA的提取 從皮損中切取約0.3×0.3×0.3 cm3組織塊。在無污染的情況下，用手術刀切小碎塊，將小碎塊轉移至2 mL EP管中。使用新鮮組織DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司，51306)提取組織DNA，最后將其溶解于AE溶解液中。

1.2.2 蠟塊組織DNA的提取 用蠟塊切片機切取13片6μm厚度蠟塊，即刻放入1.5 mL滅菌EP管內。使用蠟塊組織DNA提取試劑盒(德國Qiagen 公司，56404)提取DNA，最后將其溶解于ATE溶解液中。

1.2.3 DNA的質控和濃度的標準化 我們應用紫外-可見光分光光度計(Nano Drop 8000，美國Thermo Fisher公司)進行了DNA濃度的檢測，確保提取的DNA質量；濃度的標準化，對于濃度為50 ng/μL以上的標本，我們用無菌的雙蒸水稀釋為50 ng/μL；對于濃度低于50 ng/μL的標本，我們直接進行檢測。

1.3 qPCR檢測 應用達安基因公司的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法，Cat.#DA-052)進行檢測。PCR反應體系體積為50 μL，其中包括模板DNA 2 μL，退火溫度為55℃，擴增循環數為40，操作在AB 7500熒光定量PCR系統(美國應用生物系統公司)上進行。

2 結果

2.1 基本信息 患者基本信息及臨床診斷見表1。研究共納入確診CTB病例20例，包括尋常狼瘡(Lupus vulgaris，LV)11例和疣狀皮膚結核(Tuberculosis verrucosa cutis，TVC)9例。男12例，女8例，男女比率為1.5∶1，平均年齡為(51±13.1)歲。其中6例同時有新鮮組織和石蠟包埋組織(1例LV、5例TVC)，14例僅有石蠟包埋組織(10例LV和4例TVC)。全部確診病例中抗酸染色陽性3例(1例LV、2例TVC)。

表1 全部樣本檢測結果

注：“+”代表陽性，“-”代表陰性，“未做”代表未做此項檢查。

2.2 qPCR檢測結果 在6例新鮮組織中，3例(1例LV、2例TVC)qPCR檢測MTB陽性，敏感性為50%(3/6)(表1)；20例石蠟包埋組織中，7例(4例LV、3例TVC)經qPCR檢測MTB陽性，敏感性為35%(7/20)。其中同時有新鮮組織和石蠟包埋組織的6例患者，2例在兩種組織中qPCR檢測MTB均為陽性，1例新鮮組織為陽性，石蠟包埋組織為陰性。

3例抗酸染色陽性，敏感性為15%(3/20)。抗酸染色陽性的病例qPCR敏感性為100%(3/3)，抗酸染色陰性的病例為29.4%(5/17)。

3 討論

CTB是一種古老的傳染性疾病，占結核病的比例小于1%～2%[6,7]。近年來結核的防治卓有成效，但隨著艾滋病感染率的升高和多耐藥菌株的增加[23]，2017年全球結核新發病例數仍為1000萬例[24]，相應地CTB的發病人數不容忽視。CTB臨床表現多樣，分類眾多。其中按皮損中MTB的多少，分為多菌型和少菌型[25]。多菌型CTB因皮損中含菌量多，抗酸染色可為陽性；少菌型CTB皮損中含菌量少，抗酸染色多為陰性[26]，病原學診斷困難。我們的樣本僅有LV和TVC兩種少菌型,平均年齡為(51±13.1)歲,較文獻報道大[27,28]，抗酸染色的陽性率為15%。

qPCR技術是一種新興的病原學檢測方法，相比PCR技術，實現了從定性到定量檢測的飛躍，目前廣泛應用于生物、醫藥等領域。其操作簡單、檢測快速，敏感性高、特異性好，近年來越來越多的應用于結核的診斷中。qPCR技術應用于CTB新鮮組織MTB的檢測中敏感性為24.5%～33.3%[12,14],然而由于CTB臨床表現多樣，誤診率高達50%～52.8%[28,29]，因而在初診病理取材時，初診醫生往往未想到留取新鮮組織用于qPCR檢測。當組織病理提示可能為CTB的診斷，只能二次取材，但這不僅增加患者痛苦，而且依從性差，因此探討應用石蠟包埋組織進行qPCR檢測非常必要。

Nilgün Senturk認為CTB石蠟包埋組織PCR的敏感性降低[30]。溫晶發現麻風新鮮組織qPCR的敏感性優于石蠟包埋組織[31]。我們應用達安基因公司的qPCR檢測試劑盒檢測經前述入選標準確診的20例CTB的石蠟包埋組織和新鮮組織，總的敏感性為40%(8/20)，其中新鮮組織樣本敏感性為50%(3/6)，石蠟包埋組織樣本敏感性為35%(7/20)。與既往報道一致，新鮮組織檢測的敏感性高于石蠟包埋組織[31],但無論是對新鮮組織還是石蠟包埋組織檢測的敏感性均高于文獻報道對新鮮組織檢測的敏感性，而且我們的病例只有少菌型，文獻中的病例同時包括少菌型和多菌型[12,14]。同時有新鮮組織和石蠟包埋組織的6例患者，2例在兩種組織中qPCR檢測MTB均為陽性，1例新鮮組織qPCR檢測陽性，石蠟包埋組織中qPCR檢測結果是陰性。石蠟包埋組織假陰性結果可能是由于MTB在皮損中的分布并不均勻[14]，或者是福爾馬林導致的核酸和蛋白質交聯[32]、DNA降解導致的石蠟包埋組織的DNA提取效率下降。據文獻報道蠟塊樣本一般固定時間越久，擴增效率越低，超過5年的樣本擴增的效率明顯降低[33]。但我們有1例LV和1例TVC是固定5年以上的，檢測出了MTB。但樣本量較少，缺乏代表性。

抗酸染色是檢測結核桿菌的基本病原學方法，可應用石蠟包埋組織進行檢測，但對閱片人員的要求高，敏感性低，而且不能區分非結核分枝桿菌、諾卡氏菌、棒狀桿菌[13]。我們的樣本抗酸染色敏感性為15%,低于qPCR檢測的敏感性。Mmed報道抗酸染色陽性的樣本中PCR陽性率為55.6%(5/9),抗酸染色陰性的樣本PCR結果均為陰性[34]。Tan報道抗酸染色陽性(多菌型)的樣本PCR陽性率為64.3%(9/14)。在少菌型CTB樣本中，TVC敏感性為55%，LV為60%[35]。我們的樣本所有抗酸染色陽性的樣本qPCR檢測均為陽性。在抗酸染色陰性的樣本中敏感性為29.4%(5/17)，其中LV為30%(3/10),TVC為28.6%(2/7)。

我們的研究結果表明qPCR技術可應用于CTB新鮮組織及石蠟包埋組織中MTB的檢測，較之抗酸染色等傳統技術，qPCR敏感性、特異性更高，可輔助CTB的早期確診。在臨床工作中，如初診考慮到CTB的診斷，建議病理取材時一并留取新鮮組織進行qPCR檢測；如臨床表現不典型，在病理提示CTB診斷可能性時，利用石蠟包埋組織開展qPCR檢測也是協助病原學診斷的一種重要方式。