結合線粒體D-loop序列和SSR標記對寶石鱸養殖群體遺傳多樣性的分析

趙立祥，董浚鍵，孫成飛，田園園，胡 婕，盧邁新，葉 星

(1.農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，中國水產科學研究院珠江水產研究所，廣州 510381；2.上海海洋大學，上海 201306)

寶石鱸(Scortumbarcoo)學名高體革鯻，隸屬于鱸形目(Perciformes)鱸亞目(Percoidei)鯻科(Teraponidae)革鯻屬(Scortum)，自然分布于澳洲河流，是澳大利亞重要的游釣魚類。上世紀90年代中國山東、廣東等地陸續寶石鱸，因其肉質細膩、無肌間刺且生長速度較快等而深受消費者喜愛，現正成為中國淡水工業化養殖與池塘養殖的品種[1]。由于近年來養殖寶石鱸出現生長速度下降與病害頻發的問題，嚴重影響寶石鱸的養殖效益，也危及產品的質量安全。目前，關于寶石鱸的研究主要集中在營養成分分析、養殖技術、雜交育種和病原病害等領域，針對寶石鱸種質遺傳變異未有相關的研究報道。因此，有必要開展寶石鱸養殖種群種質情況調查，了解其遺傳多樣性及遺傳結構，綜合采用線粒體D-loop序列及SSR標記分析對4個廣東地方養殖種群的遺傳多樣性及種群間的分化進行分析，以期為寶石鱸的改良育種與苗種培育工作提供理論依據。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，廣義上它是指地球上所有生物攜帶的遺傳信息的總和，表現為多層次、多水平，遺傳多樣性不僅包括變異水平的高低，也包括變異的分布格局，即種群的遺傳結構[2]。一個物種的遺傳多樣性高低與其適應能力、生存能力和進化潛力密切相關。豐富的遺傳多樣性意味著較高的適應生存潛力，蘊藏著較大的進化潛能以及育種和遺傳改良潛力；而貧乏的遺傳多樣性則會給物種生存進化以及種質資源的保護和利用帶來許多不利影響。隨機擴增多態性(PARD)、簡單重復序列(simple sequence repeats, SSR)、簡單重復序列區間(ISSR)等標記方法以及某些線粒體基因(CO I、16SrRNA、Cytb)等常用于生物種群遺傳多樣性分析，也被應用于水產魚或蝦類野生或養殖群體的分析上[3～6]，但關于寶石鱸遺傳多樣性的研究尚未見報道。

微衛星標記，又稱短串聯重復序列(short tandem repeats, STRs)或簡單重復序列(SSR)，因其在基因組中分布廣泛，具較高的多態性、呈共顯性遺傳，且由于其分析方法相對簡便快捷也被廣泛應用于水產生物種群遺傳多樣性分析、種質資源保護等領域[7]。微衛星標記分析通常是通過PCR擴增、電泳檢測和片段大小分離分析各等位基因。傳統的片段分離采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，其分辨率和效率均較低。近年發展起來的SSR分型新方法, 通過熒光標記的PCR引物擴增微衛星位點區域序列, 對擴增產物進行毛細管電泳檢測，結合分子量內標計算DNA片段長度，使SSR分型更高效與準確[8]。

線粒體DNA(mtDNA)具有結構簡單、進化速率快、母系遺傳等特點，其中一些基因D-loop、COI、Cytb等已被作為魚類遺傳多樣性和保護生物學研究的重要標記[9～13]。DNA條形碼(DNA barcoding)技術常被用于水產動物分子鑒定研究[14]。線粒體控制區 D-loop區為非編碼區，缺乏編碼的選擇壓力，比其它線粒體基因進化速率更快，在群體遺傳變異及系統進化等研究有較多應用[15]。

本研究采用線粒體D-loop序列和SSR分析方法，對廣東4個寶石鱸養殖群體進行遺傳多樣性分析，并比較二者的分析結果，旨在更準確地了解廣東地區寶石鱸養殖群體的遺傳多樣性及種質資源狀況，為其選育種工作提供基礎依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗樣品分別采自廣東省廣州市(番禺區)、中山市和佛山市3個不同地區，其中廣州番禺群體(PY)24尾，中山群體(ZS)24尾，佛山群體1(FS1)24尾，佛山群體2(FS2)24尾，共計96尾。廣東廣州(番禺區)、中山和佛山寶石鱸養殖群體分別由廣州市番禺區農業科學研究所、中山一力農業發展有限公司和佛山市南海區西樵顯恒水產農業有限公司惠贈。

1.2 基因組DNA的提取與檢測

剪取寶石鱸新鮮個體的鰭條，無水乙醇-20 ℃保存。采用廣州美基生物科技有限公司的HiPureMollusc DNA Mini Kit軟體動物總DNA提取試劑盒，根據其說明書提取寶石鱸鰭條組織的總DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，多功能酶標儀(BioTek)檢測DNA的濃度和純度，樣品-20 ℃保存備用。

1.3 線粒體序列片段的選擇及D-loop序列片段的擴增及測序

根據GenBank中登錄的寶石鱸線粒體基因組序列(KP317810.1)[16]，設計用于擴增線粒體D-loop片段的引物(表1)，擴增長度分別為598 bp；先在8個隨機樣本中進行擴增，PCR反應體系為20 μL：TaKaRa Premix rTaq 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；之后進入30個循環：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；最后一個循環結束后72 ℃再延伸10 min后4 ℃保存。PCR產物送廣州艾基生物科技有限公司進行測序，結果發現在D-loop序列中一共檢測出8個多態性位點。

1.4 微衛星引物的篩選、擴增及基因分型

根據本實驗室前期獲得的寶石鱸肌肉組織的轉錄組數據，選取40個微衛星位點，設計并合成SSR引物，對8個隨機樣本進行PCR擴增。PCR反應體系20 μL：TaKaRa Premix rTaq 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；之后進入30個循環：94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度根據引物復性溫度設定)，72 ℃延伸1 min；最后一個循環結束后72 ℃再延伸10 min后4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的特異性，并送廣州艾基生物科技有限公司進行測序。采用Qsep100全自動核酸蛋白分析系統檢測微衛星位點多態性，從中篩選出11個特異性和多態性較好的微衛星位點，由艾基生物有限公司合成熒光引物，用于本研究4個群體的擴增(表1)。

表1 用于寶石鱸微衛星序列及D-loop擴增的引物序列及其退火溫度

SSR PCR產物分型委托艾基生物有限公司完成。11對微衛星引物分成3組分別合成3種不同熒光標記(表1)的引物，熒光標記的微衛星引物分別擴增微衛星位點區域序列，3種不同熒光PCR產物混合成一管樣品進行檢測。采用3730XL測序分析儀(ABI)對樣品的熒光PCR產物進行毛細管電泳檢測，結合分子內標進行DNA片段長度計算，根據每個擴增條帶分子量的差異性, 判斷每個個體各基因座的基因型。

1.5 數據分析

使用Cluatal X軟件比對D-loop序列測序結果，并輔以人工校對。利用MEGA 6軟件統計序列的堿基含量，利用鄰接法基于K2P模型構建寶石鱸4個養殖群體的單倍型系統發生樹，進化樹各分支的自舉置信度水平由自舉法(bootstrap value)估計，自引導次數為1 000。通過DnaSP軟件統計單倍型(h)，計算單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性遺傳多樣性(Pi)等參數。

SSR分析中獲得微衛星位點上等位基因的條帶大小后，將所得結果進行歸類。使用POPGENE Version 1.31 進行統計分析，計算各群體每個微衛星位點的等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Shannon 指數(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、遺傳距離和基因流(Nm)。根據Nei's遺傳距離以及非加權配對算術平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)，利用 MEGA 6軟件分別構建群體間和個體間的系統進化樹。CERVUS3.0軟件計算多態信息含量(polymorphism information content,PIC)。ARLEQUIN 3.5軟件計算遺傳分化指數(FST)并進行群體分子方差分析(AMOVA)。群體遺傳結構采用STRUCTURE2.3 進行分析。

2 結果

2.1 寶石鱸mtDNA D-loop序列、群體遺傳多樣性與群體遺傳分化分析

對寶石鱸4個群體共96個樣本的mtDNA D-loop基因片段進行了擴增與測序，通過比對和人工校對，選擇了598 bp的序列用于進一步的分析。共獲得變異位點14個，含有3個簡約信息位點，1個堿基位點缺失，1個堿基位點插入。變異位點數占分析位點的2.34%。4種堿基在此段序列中的平均含量為A(30.4%)、T(31.8%)、C(20.1%)、G(17.7%)，其中A+T含量為62.2%，明顯高于C+G含量。

從96個樣本中共定義8個單倍型(Hap)，其中單倍型Hap1為ZS和FS1、FS2 3個群體的共享單倍型，Hap3為PY和FS1、FS2 3個群體的共享單倍型，其它6個單倍型(Hap2, Hap4-8)為各群體特有(表2)。其中FS1群體擁有的單倍型最多，為6個；PY群體次之，為3個；FS2群體較少，為2個；ZS群體擁有單倍型最少為1個。Hap1和Hap3為優勢單倍型，分別占個體總數的60.4%、32.3%。

表2 寶石鱸4個養殖群體中D-loop序列單倍型的分布

使用Dna SP(version 5.0)軟件計算寶石鱸4個養殖群體的2個遺傳多樣性參數：單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)。4個群體的Hd為0.000 0～0.543 5，以FS1群體為最高、ZS群體最低；Pi為0.000 00～0.001 76，其中FS1群體的Pi值最高(0.001 76)，而ZS群體不存在Pi(0.000 00)(表3)。表明4個養殖群體的遺傳多樣性均極低。

表3 寶石鱸4個群體線粒體D-loop序列的遺傳多樣性參數

2.2 寶石鱸SSR遺傳多樣性分析

根據轉錄組數據設計篩選到11對微衛星引物對，在4個寶石鱸群體中有較好的多樣性(表4)，進一步用這11對微衛星引物對4個寶石鱸群體共96個個體進行擴增與分型。結果顯示，11個微衛星位點在96個樣本中的PIC為0.233～0.609，平均PIC為0.391(表5)。各位點的基因流Nm為2.678～98.617(>1)，平均Nm為7.483。

表4 寶石鱸11個微衛星位點在4個群體中的預擴增情況

Tab.4 Characterization of 11 microsatellite loci for 4 populations ofS.barcoo

位點基因大小基因型尾數PYZSFS1FS1L0262A=202B=208C=247AC---3BB2123BC111355CC11101713L0818A=226B=229C=232AA2-11AB6879BB-12-BC16151414L1002A=185B=197AA10533AB14182119BB-1-2L1766A=226B=247AA3279AB1520510BB62125L2017A=106B=109AA1-51AB181886BB561117L2052A=226B=246AB101434BB14102120L2462A=197B=232C=245AA121078AC10131716BB1---CC11--L2923A=202B=208C=211D=214AC---1BC1382123CD11162-L4246A=234B=240C=243D=246E=279AE96-1BB-1--BE-112CE11-1DE-2--EE14132320

續表

表5 寶石鱸96個樣品中11個微衛星位點的多樣性參數

PY、ZS、FS1和FS2 4個群體的平均He為0.491、0.516、0.396、0.424，平均PIC為0.405、0.420、0.320、0.347，顯示4個群體的遺傳多樣性均較低。ZS群體的遺傳多樣參數略高于其它三個群體，但4個群體之間的He和PIC不存在顯著性差異(表6)。

下表(表7)是4個寶石鱸群體根據線粒體D-loop序列和SSR位點的AMOVA分析結果，基于線粒體D-loop序列分析 4個群體間遺傳分化系數FST=0.403 5，顯示群體間具有較高程度的遺傳分化，而SSR的分析結果顯示FST極低，僅為0.044 5，二者差異較大。而對于遺傳變異來源的分析二者的結果則相近。基于線粒體D-loop序列分析，遺傳變異有40.34%來自于群體間，59.66%來自于群體內；根據11個SSR位點的分析遺傳變異來源，39.28%來自于群體間，60.72%來自群體內。

表6 4個寶石鱸群體11個位點的平均遺傳多樣性參數

注：同列數據上標相同字母表示不存在顯著性差異

表7 4個寶石鱸群體根據線粒體D-loop序列和SSR位點的AMOVA分析結果

4個群體兩兩間的Nei’s遺傳相似度和遺傳距離如表8所示，其中遺傳相似度為0.953 7～0.987 6，遺傳距離為0.012 5～0.047 4。根據遺傳距離構建的UPGMA系統進化樹，4個養殖群體分聚成了2類，PY群體和ZS群體聚為一支，FS1、FS2兩個群體聚為另一支(圖1)。根據96尾寶石鱸個體間的遺傳距離構建的UPGMA進化樹(圖2)顯示4個群體呈鑲嵌式排列，未出現明顯的群體分支。

表8 4個寶石鱸群體的遺傳相似度和遺傳距離

注：對角線以上為遺傳相似度，對角線以下為遺傳距離

圖1 基于Nei’s遺傳距離構建的4個寶石鱸群體的UPGMA聚類樹

圖2 基于Nei’s遺傳距離構建的96個寶石鱸個體的UPGMA聚類樹

運用STRUCTURE軟件分析4個群體的遺傳結構，結果顯示對數似然函數值L(K)隨亞群數K的增加而增加，當K=2時L(K)值開始趨于穩定，開始出現平臺期，說明這4個群體可分為2個亞群(圖3)。其中PY、ZS、FS1、FS2 4個群體中分別有62.5%、75%、8.3%和20.8%為亞群I，37.5%、25%、91.7%和69.2%為亞群Ⅱ(圖4)，也即PY與ZS群體大部分個體為亞群I，而FS1與FS2群體大多屬于亞群Ⅱ。

圖3 L(K)值隨K的變化

圖4 參試4個寶石鱸群體在K=2時的遺傳結構圖

3 討論

3.1 基于線粒體D-loop序列的寶石鱸群體遺傳多樣性

本研究利用線粒體D-loop 序列片段(598 bp)，分析4個寶石鱸養殖群體共96個樣本，共檢測出14個多態性位點，定義了8個單倍型，并計算了核苷酸多樣性指數Pi和線粒體DNA的單倍型多樣性指數Hd。這二個參數是衡量群體DNA多態程度的重要指標[17]。從單倍型多樣度(Hd=0.000 0～0.543 5，平均0.535)和核苷酸多樣性(Pi=0.000 00～0.001 76，平均0.001 39)的數值來看，本研究所分析的寶石鱸4個養殖群體的多樣性均較低。王沈同等[18]利用線粒體控制區片段(894 bp)對草魚野生及選育群體進行遺傳變異分析，6個群體共276個樣本檢測出27種單倍型，野生群體和選育群體的單倍型多樣度及核苷酸多樣性分別為Hd=0.585 5、Pi=0.001 42，而選育群體的分別為Hd=0.429、Pi=0.000 92，說明野生群體的遺傳多樣性遠比選育群體更豐富。董新培等[19]利用906 bp的線粒體D-loop區片段對不同地理區域的104個烏鱧樣本進行遺傳多樣性分析，結果顯示在104條序列中出現37個多態性位點，共定義27種單倍型。烏鱧遺傳群體的多樣性參數分別為Hd=0.875、Pi=0.003 72，說明烏鱧群體的遺傳多樣性較為豐富。本研究中寶石鱸的4個養殖群體的多樣性均低于上述草魚與烏鱧研究中的野生群體，但高于王沈同等的研究中草魚選育群體的對應參數(Hd=0.429、Pi=0.000 915)。

遺傳分化指數FST多用于分析不同群體間的遺傳差異，FST為0～0.05，表明群體間分化比較??；若FST為0.05～0.15，則群體間存在中等程度分化水平；若FST>0.15，群體間存在較高的分化水平[17]。本研究根據線粒體D-loop序列分析的4個寶石鱸養殖群體的遺傳分化指數為FST=0.403 5，處于較高的分化水平。王沈同等[18]的研究(FST=0.403 12)中的草魚群體以及董新培等[19]的研究(FST=0.319 14)中烏鱧群體的結果相差不大，三者的分化水平相當。

通過mtDNA D-loop序列對寶石鱸4個養殖群體的分析，顯示4個養殖群體遺傳多樣性均較低，遺傳分化指數FST=0.403 5顯示群體間遺傳分化處于較高水平。4個養殖群體的遺傳分化主要來自群體內部(59.66%)。

3.2 基于微衛星位點的寶石鱸群體遺傳多樣性

在利用SSR進行種群遺傳多樣性的評估中，常用群體PIC和雜合度(H)兩個指標。PIC能反映出某個群體的遺傳變異程度和位點多樣性[20]，PIC>0.5的位點為高多態性位點，0.250.25，均具有中等以上的多態性。雜合度(H)用于描述群體遺傳學上的群體多態性，雜合度越高物種遺傳多樣性越豐富，對環境的適應能力越強[22]，當期望雜合度處在0.5～0.8之間即可認為該群體具有較高的多樣性。本實驗中檢測的4個寶石鱸養殖群體平均期望雜合度處于0.396～0.516，僅有中山群體的平均期望雜合度略大于0.5，說明總體上這些養殖群體的遺傳多樣性均偏低。根據SSR分型結果計算群體間的遺傳分化分析結果顯示FST= 0.044 5，說明群體間的遺傳分化水平較低(FST<0.05)，也證明了4個群體之間的遺傳相似度較高，與Nei’s遺傳相似度和遺傳距離分析結果一致。

Nm是指一些個體從一個群體遷移至另一個群體過程中將某些基因帶入新群體，它對新群體的變異產生影響。不同群體間的基因流越大，遺傳相似性越高。當Nm>1 時，可認為群體之間的基因流較大，遺傳相似性較高[23]。本研究中的4個群體各位點的基因流均較高(Nm>1)，因此說明4個群體遺傳相似性高。個體間遺傳進化樹(圖2)則反映出這些個體未因群體差異或來源而呈現出明顯的分群，從另一角度說明這4個群體間遺傳相似度較高。STRUCTURE 軟件是根據Pritchard等的方法開發而成[24]，它根據多位點基因型數據來劃分群體的結構組成，將每個個體分配到不同亞群中，可分析群體間的混合區以及群體間的遷移等。K值反映了群體的亞群數，在ΔK最大時，其對應的K值為適宜的亞群數[25]。本研究中通過STRUCTURE軟件分析，各群體中的個體均被分成2個亞群，但其中番禺群體和中山群體中有更多個體屬于亞群Ⅰ，佛山的2個群體則更多個體屬于亞群Ⅱ，提示中山群體與番禺群體、佛山群體1與群體2的遺傳關系較近，這與群體間遺傳進化樹(圖1)分析結果一致。

基于11個微衛星位點的分析，4個養殖群體的遺傳多樣性水平偏低，其中中山群體的遺傳多樣性水平較高，遺傳分化指數FST=0.044 5顯示群體間遺傳分化處于較低水平。遺傳變異來源與D-loop的分析結果相似，主要為群體內部(60.72%)。

3.3 綜合兩種分析方法分析4個群體的遺傳多樣性

本研究通過線粒體D-loop序列和SSR分析，均顯示4個寶石鱸養殖群體的遺傳多樣性水平較低。根據SSR分析結果，中山群體在4個群體中多樣性相對較高，其期望雜合度(He=0.516)屬于中等水平。但根據D-loop序列分析結果來看中山群體的線粒體D-loop序列不存在多態性位點，全部個體屬于同一單倍型。這可能與線粒體DNA的遺傳特殊性有關。線粒體為母系遺傳，遺傳過程不經過基因重組[9]，因此對于親緣關系較近的分析樣本而言，用其分析種群遺傳多樣性具有局限性。本研究的預實驗還發現寶石鱸線粒體Cytb、COI和12S rRNA上的多態性位點更少，不適合用于對現有寶石鱸養殖群體的遺傳多樣性評估。

兩種分析方法的結果均顯示4個群體的遺傳分化大部分來自于群體內。但兩種方法所得的群體遺傳分化指數FST差異較大，根據線粒體D-loop序列獲得的FST較大，(FST=0.403 5 >0.15)，說明群體間的遺傳分化處于較高水平，而根據微衛星位點的分析結果(FST=0.044 5)，群體間遺傳分化偏低。兩者在群體遺傳分化指數上的不同可能是由于兩者遵循不同的遺傳模式而導致變異速率存在差異[26]。如果種群間的基因流是由雄性個體造成的，那么就只有用核基因標記才能檢測，因此微衛星標記在研究種群遺傳分化時可以獲得更為完善的信息[27]。寶石鱸引進時間較長、批次較少，而性成熟時間較長(雌魚3年性成熟，雄魚成熟時間則更長為5年)，這就導致在繁殖過程中一尾雄魚可能與多尾雌魚配對，導致雄性產生的基因流大于雌性，所以對于本研究而言，使用SSR分析群體的遺傳分化應更為準確。

本研究使用SSR和線粒體D-loop序列分析寶石鱸4個養殖群體的遺傳多樣性，結果顯示4個群體的遺傳多樣性較低、群體間遺傳分化水平較低、遺傳距離很小，親緣關系較近，說明這4個養殖群體進一步選育的潛力不足，因此有必要通過引進原種以豐富國內寶石鱸養殖群體的遺傳多樣性。本研究結果可為下一步寶石鱸種質改良與品種選育提供依據。