含4 種食源性病毒檢測靶標多聯(lián)裝甲RNA的制備、純化與定值

姚 琳，張 奇，李風鈴，張 媛，逄鳳嬌，江艷華,*，王聯(lián)珠，翟毓秀

（1.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室，山東 青島 266071；2.獐子島集團股份有限公司，遼寧 大連 116001）

諾如病毒（norovirus，NoV）、甲肝病毒（hepatitis A virus，HAV）、輪狀病毒（rotavirus，RV）、星狀病毒（astrovirus，AstV）等食源性病毒引發(fā)的公共衛(wèi)生與食品安全問題已成為影響全球人類健康的主要問題[1-2]。2006—2007年，日本、英國爆發(fā)NoV疫情，造成共約500萬 人感染；1988年我國上海爆發(fā)HAV疫情，造成約30萬 人感染；RV是嬰幼兒腹瀉的主要病原，世界范圍內(nèi)每年估計約有5%的兒童死于RV感染[3]；目前AstV在一些國家的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)已相當普遍，陽性檢出率在2%～8%之間[4-5]。食源性病毒可通過受污染的水、貝類、果蔬等引起疾病的爆發(fā)和流行[6-7]。實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）是檢測食品中食源性病毒的最主要方法。由于食品基質(zhì)復雜、干擾因素多且病毒含量較低，通常需要在檢測過程中添加陽性質(zhì)控樣品，以確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。對于上述RNA病毒，近年來有研究者采用體外轉(zhuǎn)錄的裸露RNA片段作為實時熒光定量RT-PCR質(zhì)控樣品[8-10]，但存在不能監(jiān)控病毒粒子裂解、RNA提取等關(guān)鍵環(huán)節(jié)且易降解等缺點。

針對上述問題，Dubois等[11]建立了裝甲RNA技術(shù)，即通過分子生物學手段將目標RNA片段包裹在MS2噬菌體病毒樣顆粒（virus like particles，VLPs）內(nèi)部，使之能抵抗環(huán)境和樣本中核酸酶的降解，同時其整體結(jié)構(gòu)又很好地模擬了病毒衣殼蛋白-核酸天然存在的特征，具有穩(wěn)定、無生物安全隱患、可有效評價病毒裂解與提取效率等檢測全過程的優(yōu)點，該技術(shù)已成功應用于腸道病毒[12]、人體免疫缺陷病毒[13]等病毒的陽性質(zhì)控樣品的制備。然而，目前鮮見可同時適于多種病毒檢測陽性質(zhì)控樣品的研究報道。

本研究在前期構(gòu)建基于Qβ噬菌體的裝甲RNA制備平臺的基礎(chǔ)上[14]，針對食源性病毒的主要檢測標準，研究并純化了同時包含NoV、HAV、RV、AstV 4 種食源性病毒檢測靶標的多聯(lián)裝甲RNA，并對其進行初步定值，為研發(fā)用于食源性病毒核酸檢測的多聯(lián)陽性質(zhì)控樣品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3）和Top10感受態(tài)細胞 天根生化科技（北京）有限公司；pET-28a（+）載體為本實驗室保存；pGEM-T-Easy載體、T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System 美國Promega公司；同源重組克隆試劑盒ClonExpress?II One Step Cloning Kit 南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、Premix Ex TaqTM、One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit 寶生物工程（大連）有限公司；丙烯酰胺葡聚糖凝膠（SephacryI S-200 HR） 北京天恩澤生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑 Invitrigen公司；異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）、卡納霉素、氯化銫（均為分析純） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LightCycler 2.0實時熒光PCR儀 瑞士Roche公司；NanoPhotometer Pearl微量核酸蛋白測定儀 德國Implen公司；JEM-1200透射電鏡 日本電子公司；Infinity 3006凝膠成像系統(tǒng) 法國Vilber Lourmat公司；Lambda750紫外-可見近紅外分光光度計 美國PerkinElmer公司；BS-100A自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 引物與探針

引物與探針由北京六合華大基因科技有限公司（以下簡稱華大基因）合成，相關(guān)信息見表1。

1.3.2 目的片段QβMulV和MulV的合成

根據(jù)ISO/T 15216-2 2012、GB/T 22287—2008《貝類中甲型肝炎病毒檢測方法 普通RT-PCR方法和實時熒光RT-PCR方法》、SN/T 2520—2010《貝類中A群輪狀病毒檢測方法 普通PCR和實時熒光PCR方法》、SN/T 2519—2010《貝類中星狀病毒檢測方法 普通PCR和實時熒光PCR方法》等國際標準、國家標準、行業(yè)標準分別規(guī)定的NoV（GI型和GII型）、HAV、RV、AstV檢測靶標，由華大基因合成同時含有上述4 種病毒檢測靶標RNA對應cDNA的串聯(lián)序列，命名為MulV。

參考GenBank數(shù)據(jù)庫中的Qβ噬菌體基因組序列（AB971354），由華大基因合成包含Qβ噬菌體成熟酶編碼基因、衣殼蛋白編碼基因、包裝位點序列、MulV的核酸片段，命名為QβMulV。

1.3.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

將核酸片段MulV亞克隆至pGEM-T-Easy載體中，構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄用重組質(zhì)粒，酶切鑒定后送至華大基因測序。

參考同源重組克隆試劑盒的說明書，將核酸片段QβMulV亞克隆到pET-28a（+）載體中，構(gòu)建原核表達用重組質(zhì)粒，酶切鑒定后送至華大基因測序。

1.3.4 病毒樣顆粒的誘導表達

將原核表達用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，取2 mL菌液接種于200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為0.6，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導表達12 h，離心收集菌液，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.5 病毒樣顆粒的純化

將1.3.4節(jié)收集的菌液采用超聲波破碎，4 ℃、11 000 r/min離心20 min收集上清后分別加入終濃度為8 U/mL的DNase I和12 μg/mL的RNase A消化，用0.45 μm濾膜過濾后進行氯化銫密度梯度離心，4 ℃、80 000 r/min離心5 h，小心吸取含VLPs的目標層液體，通過SephacryI S-200 HR層析柱進一步純化，用自動樣品收集器每10 min收集一管樣品。將各收集管樣品測定在260 nm和280 nm波長處的吸光度，并進行SDS-PAGE分析。獲得同時含有4 種食源性病毒檢測靶標的多聯(lián)裝甲RNA，命名為AR-MulV。

1.3.6 電鏡觀察

將AR-MulV用2%磷鎢酸負染，在JEM-1200型透射電子顯微鏡下觀察VLPs形態(tài)。

1.3.7 AR-MulV中殘留質(zhì)粒的檢測

以純化后的AR-MulV為模板，用實時熒光定量PCR法檢測其中是否含有殘留重組質(zhì)粒；同時設(shè)置pETQβMulV為陽性對照，無酶ddH2O為空白對照；每個樣品設(shè)置3 個平行。檢測用引物與探針參見表1，反應體系見表2，循環(huán)參數(shù)：95 ℃預變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸20 s，40 個循環(huán)。

1.3.8 AR-MulV的初步定值1.3.8.1 cRNA制備

用限制性內(nèi)切酶線性化體外轉(zhuǎn)錄用重組質(zhì)粒，用T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄；體系如下：RioMAXTMExpress T7 2 μL，Buffer 10 μL，Linear DNA Template 8 μL，Enzyme Mix T7 Express 2 μL；37 ℃溫育30 min后，加入1 μL的RQ1 RNase-Free DNase，37 ℃溫育15 min，除去DNA模板。用Trizol法提取cRNA。

1.3.8.2 標準曲線構(gòu)建

使用微量核酸蛋白測定儀測定cRNA的濃度。計算拷貝數(shù)按照：拷貝數(shù)/（copies/μL）＝（6.02×1023拷貝/mol×RNA含量/（ng/μL）×10-9）/（片段長度/bp×340），將cRNA進行10 倍梯度稀釋，用對應的引物與探針分別對4 種食源性病毒檢測靶標進行實時熒光定量RT-PCR分析，每個樣品設(shè)置3 個平行，體系見表3。循環(huán)參數(shù)為42 ℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95 ℃變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸20 s，40 個循環(huán)。根據(jù)所測得的Ct值與cRNA各梯度稀釋拷貝數(shù)的對數(shù)繪制標準曲線。

表 3 4 種食源性病毒的實時熒光定量RT-PCR體系Table 3 Real-time RT-PCR system for detection of four foodborne viruses

1.3.8.3 初步定值與不確定度分析

將純化后的AR-MulV用無酶磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.2）適度稀釋，分裝到1.5 mL無酶離心管中，參考JJF 1006—1994《一級標準物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》的要求，隨機選取15 管AR-MulV，采用1.3.8.2節(jié)中的實時熒光定量RT-PCR方法分別測定各食源性病毒的Ct值，根據(jù)標準曲線，得到15 管AR-MulV中4 種食源性病毒5 個檢測靶標拷貝數(shù)，參考JJF 1006—1994中格布拉斯準則剔除可疑數(shù)據(jù)后，計算平均值，得到AR-MulV中各食源性病毒檢測靶標初步定值結(jié)果。不確定度分析參考JJF 1059—1999《測量不確定度表示指南》，采用A類不確定度評定方法，按照以下公式進行計算：

式中：tα（m-1）為顯著性水平α、自由度為m-1的t值；為單次測量的平均值；為測量的總平均值；m為測量次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖 1 pGEM-MulV的酶切鑒定電泳圖Fig. 1 Enzyme digestion of pGEM-MulV

圖 2 pET-QβMulV的酶切鑒定電泳圖Fig. 2 Enzyme digestion of pET-QβMulV

分別用限制性內(nèi)切酶Spe I單酶切和Spel I/Sph I雙酶切鑒定體外轉(zhuǎn)錄用重組質(zhì)粒，大小與預期一致，電泳結(jié)果如圖1所示，測序結(jié)果正確，證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pGEM-MulV。分別用限制性內(nèi)切酶BamH I單酶切和BamH I/Hind III雙酶切鑒定原核表達用重組質(zhì)粒，大小與預期一致，電泳結(jié)果如圖2所示，測序結(jié)果正確，證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pET-QβMulV。

2.2 pET-QβMulV在大腸桿菌中的誘導表達

pET-QβMulV轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）后，經(jīng)IPTG誘導表達，用SDS-PAGE檢測，在約14.1 kDa處出現(xiàn)一條明顯的重組蛋白表達條帶（圖3），大小與預期一致，表明Qβ噬菌體衣殼蛋白成功表達。

圖 3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expression product

2.3 樣品的純化

圖 4 丙烯葡聚糖凝膠層析純化不同收集管樣品吸光度分析結(jié)果Fig. 4 Absorbance of different fraction after purification by Sephacryl S-200 HR gel exclusion chromatography

圖 5 吸收峰附近樣品SDS-PAGE結(jié)果Fig. 5 SDS-PAGE analysis of samples around absorbent peak

如圖4所示，第21管在260 nm和280 nm波長處均有最大吸光度，說明該管中核酸（即靶標RNA）與蛋白（即VLPs）含量均最高，即該管中AR-MulV含量最高。第19～24管樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果見圖5，可見第21、22管樣品在14.1 kDa處均有條帶且濃度高無雜帶，說明純化效果好。本研究選取第21管樣品用無酶PBS（pH 7.2）適度稀釋后進行后續(xù)實驗。

2.4 電鏡觀察結(jié)果

在電鏡下觀察純化后的AR-MulV，可見大量結(jié)構(gòu)完整、大小均一的病毒樣顆粒，直徑約25 nm，與預期大小一致，結(jié)果如圖6所示。

圖 6 AR-MulV電鏡照片F(xiàn)ig. 6 Electron microscopy image of AR-MulV

2.5 AR-MulV中殘留質(zhì)粒的檢測結(jié)果

圖 7 AR-MulV殘留質(zhì)粒實時熒光定量PCR檢測結(jié)果Fig. 7 Real-time PCR for residual plasmid DNA detection in the AR-MulV

如圖7所示，以AR-MulV為模板，分別用4 種食源性病毒的5 個檢測靶標對應的引物和探針進行檢測的實驗組和空白對照組，在陰性判定Ct值內(nèi)均未出現(xiàn)特異性擴增；以pET-QβMulV為陽性對照的實驗組每對引物與探針均出現(xiàn)明顯的特異性擴增，且Ct值均在陽性判定值內(nèi)，說明純化的AR-MulV中無重組質(zhì)粒殘留，純度良好。

2.6 AR-MulV初步定值

2.6.1 cRNA標準曲線的構(gòu)建

以10 倍稀釋梯度的cRNA為模板，利用4 種食源性病毒的引物與探針，分別進行實時熒光定量RT-PCR檢測。以cRNA各稀釋梯度的對數(shù)為橫坐標，以Ct值為縱坐標建立實時熒光定量RT-PCR的標準曲線，其線性方程見表4。

表 4 4 種食源性病毒的cRNA標準曲線Table 4 Calibration curves for cRNA of four foodborne virus

2.6.2 AR-MulV的初步定值與不確定度分析

用對應的實時熒光定量RT-PCR方法檢測15 管AR-MulV，計算獲得AR-MulV中該食源性病毒靶標核酸拷貝數(shù)，同時計算A類不確定度。定值結(jié)果見表5，AR-MulV中GI型NoV、GII型NoV、HAV、RV和AstV檢測靶標RNA的含量分別為（1.24±0.2）×107、（2.54±0.6）×107、（2.24±0.3）×107、（2.96±0.5）×107copies/μL和（3.19±0.4）×107copies/μL。

表 5 AR-MulV中4 種食源性病毒靶標RNA初步定值結(jié)果Table 5 Quantification of AR-MulV for 4 foodborne viruses

3 討 論

目前食源性病毒檢測標準中的陽性質(zhì)控樣品主要有致弱的活病毒或cDNA/質(zhì)粒DNA兩大類，前者需要進行病毒培養(yǎng)，存在一定生物安全隱患，并且需使用與目標病毒不同的引物、探針，操作繁瑣；后者無法監(jiān)控病毒裂解、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄等多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。此外，也有將體外轉(zhuǎn)錄cRNA作為陽性質(zhì)控樣品[8-10,15]，雖然可以評價反轉(zhuǎn)錄的過程，但存在易降解的短板。利用裝甲RNA技術(shù)制備的陽性質(zhì)控樣品在最大程度上模擬病毒粒子，可在檢測過程中添加到實際樣本或空白樣本中，對目標病毒的裂解、RNA提取、檢測等關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行全程評價，無生物安全隱患，穩(wěn)定性高。對于某些高變異性的RNA病毒，在確定檢測靶序列的前提下，可在28 d內(nèi)構(gòu)建、制備、純化出新的裝甲RNA[16]，在自身有合成基因、測序條件的實驗室，不考慮定值，只制備定性陽性質(zhì)控樣品，周期可縮短至20 d；有研究表明，裝甲RNA的穩(wěn)定性很好，在-20 ℃條件下至少可保存120～200 d[14,25]、-80 ℃條件下至少可保存300 d[14]，這種較短的制備周期與優(yōu)良的穩(wěn)定性也是裝甲RNA的重要優(yōu)勢[16]。裝甲RNA技術(shù)完全可彌補致弱的活病毒、cDNA/質(zhì)粒DNA和cRNA作為陽性質(zhì)控樣品的不足[17-18]，因此該技術(shù)已成為RNA病毒核酸檢測陽性質(zhì)控樣品研發(fā)的重要發(fā)展方向[18-21]，尤其對于烈性傳染性病毒、新發(fā)病毒和無法進行體外培養(yǎng)病毒而言有著無可替代的優(yōu)勢，現(xiàn)已成功制備人體免疫缺陷病毒[13]、猴免疫缺陷病毒[22]、冠狀病毒[23]、口蹄疫病毒[24]、寨卡病毒[16]、腸道病毒[12]等重要病原的裝甲RNA。

本研究在純化了AR-MulV后，為明確其所含各食源性病毒檢測靶標RNA的拷貝數(shù)，使之今后能更好地用于定量評價檢測方法、儀器設(shè)備靈敏度等領(lǐng)域，探索性地對其進行初步定值研究。目前對于裝甲RNA的定值主要有3 種方式：1）使用線性化質(zhì)粒DNA為模板構(gòu)建標準曲線[22]；2）使用體外轉(zhuǎn)錄cRNA為模板構(gòu)建標準曲線[25]；3）以制備的裝甲RNA提取的RNA為模板構(gòu)建標準曲線[26-27]。有研究結(jié)果表明，體外轉(zhuǎn)錄的cRNA為標準品更接近樣本RNA的真實拷貝數(shù)[28]，所以本研究以體外轉(zhuǎn)錄的cRNA為模板構(gòu)建標準曲線對制備的AR-MulV進行初步定值。結(jié)果表明，即使經(jīng)過稀釋，AR-MulV所含的4 種食源性病毒的檢測靶標RNA均可達到107copies/μL。在技術(shù)成熟的實驗室，理論上講，100 mL的誘導菌液可制備10 L以上的107copies/μL高拷貝數(shù)的樣品，產(chǎn)量大。后期對其進行聯(lián)合定值，明確其穩(wěn)定性、均勻性等重要特性后，將有望申報有證標準參考樣品。

NoV、HAV、RV、AstV這4 種食源性病毒已成為質(zhì)檢、疾控、出入境等機構(gòu)的重要檢測項目，本研究基于目前通行的國際標準、國家標準、行業(yè)標準中涉及的食源性病毒檢測靶標，制備多聯(lián)裝甲RNA，與分別制備的方法相比，節(jié)省時間與研究精力。此外，為滿足食品安全與公共衛(wèi)生安全等領(lǐng)域的需要，多重實時熒光定量RT-PCR成為快速篩查食源性病毒的重要手段，目前國內(nèi)外學者已成功建立了NoV、HAV、RV和AstV[1]，GI型和GII型NoV[29]，NoV、RV、HAV和柯薩奇病毒[30]，GI型、GII型NoV和HAV[31]等多重實時熒光定量RT-PCR檢測方法，能夠快速、特異、靈敏地同時檢測多種食源性病毒。在應用上述多重檢測方法時，如果對涉及到的每種食源性病毒均設(shè)置單一的陽性質(zhì)控樣品，則需同時對多種相應的質(zhì)控樣品分別添加、提取、擴增等，操作繁瑣，難以滿足應對突發(fā)性食品安全與公共衛(wèi)生事件對檢測時效性的要求。針對上述需求，可基于本研究開發(fā)的多聯(lián)裝甲RNA研發(fā)平臺，根據(jù)多重實時熒光定量RT-PCR方法對應的擴增靶標序列，快速制備多聯(lián)裝甲RNA，滿足多種病毒的快速高通量檢測對陽性質(zhì)控樣品的需求。多重實時熒光定量RT-PCR檢測方法與多聯(lián)裝甲RNA聯(lián)合使用，可縮短樣品檢測時間，提高檢測結(jié)果的可靠性。

綜上所述，本研究基于Qβ噬菌體裝甲RNA技術(shù)，成功研制出同時包含NoV、HAV、RV和AstV 4 種食源性病毒檢測靶標的多聯(lián)裝甲RNA，無殘留DNA，RNA拷貝數(shù)高，后期經(jīng)穩(wěn)定性、均勻性評價后，可作為多種病毒分子檢測的陽性質(zhì)控樣品供質(zhì)檢、科研人員選擇使用，為食源性病毒標準化檢測提供安全的標準參考樣品提供參考依據(jù)，也為多重實時熒光定量RT-PCR配套使用的多聯(lián)陽性質(zhì)控樣品的制備提供了新思路。