含4 種食源性病毒檢測靶標多聯裝甲RNA的制備、純化與定值

姚 琳，張 奇，李風鈴，張 媛，逄鳳嬌，江艷華,*，王聯珠，翟毓秀

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業部水產品質量安全檢測與評價重點實驗室，山東 青島 266071；2.獐子島集團股份有限公司，遼寧 大連 116001）

諾如病毒（norovirus，NoV）、甲肝病毒（hepatitis A virus，HAV）、輪狀病毒（rotavirus，RV）、星狀病毒（astrovirus，AstV）等食源性病毒引發的公共衛生與食品安全問題已成為影響全球人類健康的主要問題[1-2]。2006—2007年，日本、英國爆發NoV疫情，造成共約500萬 人感染；1988年我國上海爆發HAV疫情，造成約30萬 人感染；RV是嬰幼兒腹瀉的主要病原，世界范圍內每年估計約有5%的兒童死于RV感染[3]；目前AstV在一些國家的調查中發現已相當普遍，陽性檢出率在2%～8%之間[4-5]。食源性病毒可通過受污染的水、貝類、果蔬等引起疾病的爆發和流行[6-7]。實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）是檢測食品中食源性病毒的最主要方法。由于食品基質復雜、干擾因素多且病毒含量較低，通常需要在檢測過程中添加陽性質控樣品，以確保檢測結果的準確性和可靠性。對于上述RNA病毒，近年來有研究者采用體外轉錄的裸露RNA片段作為實時熒光定量RT-PCR質控樣品[8-10]，但存在不能監控病毒粒子裂解、RNA提取等關鍵環節且易降解等缺點。

針對上述問題，Dubois等[11]建立了裝甲RNA技術，即通過分子生物學手段將目標RNA片段包裹在MS2噬菌體病毒樣顆粒（virus like particles，VLPs）內部，使之能抵抗環境和樣本中核酸酶的降解，同時其整體結構又很好地模擬了病毒衣殼蛋白-核酸天然存在的特征，具有穩定、無生物安全隱患、可有效評價病毒裂解與提取效率等檢測全過程的優點，該技術已成功應用于腸道病毒[12]、人體免疫缺陷病毒[13]等病毒的陽性質控樣品的制備。然而，目前鮮見可同時適于多種病毒檢測陽性質控樣品的研究報道。

本研究在前期構建基于Qβ噬菌體的裝甲RNA制備平臺的基礎上[14]，針對食源性病毒的主要檢測標準，研究并純化了同時包含NoV、HAV、RV、AstV 4 種食源性病毒檢測靶標的多聯裝甲RNA，并對其進行初步定值，為研發用于食源性病毒核酸檢測的多聯陽性質控樣品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3）和Top10感受態細胞 天根生化科技（北京）有限公司；pET-28a（+）載體為本實驗室保存；pGEM-T-Easy載體、T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System 美國Promega公司；同源重組克隆試劑盒ClonExpress?II One Step Cloning Kit 南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內切酶、Premix Ex TaqTM、One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit 寶生物工程（大連）有限公司；丙烯酰胺葡聚糖凝膠（SephacryI S-200 HR） 北京天恩澤生物技術有限公司；Trizol試劑 Invitrigen公司；異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）、卡納霉素、氯化銫（均為分析純） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LightCycler 2.0實時熒光PCR儀 瑞士Roche公司；NanoPhotometer Pearl微量核酸蛋白測定儀 德國Implen公司；JEM-1200透射電鏡 日本電子公司；Infinity 3006凝膠成像系統 法國Vilber Lourmat公司；Lambda750紫外-可見近紅外分光光度計 美國PerkinElmer公司；BS-100A自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 引物與探針

引物與探針由北京六合華大基因科技有限公司（以下簡稱華大基因）合成，相關信息見表1。

1.3.2 目的片段QβMulV和MulV的合成

根據ISO/T 15216-2 2012、GB/T 22287—2008《貝類中甲型肝炎病毒檢測方法 普通RT-PCR方法和實時熒光RT-PCR方法》、SN/T 2520—2010《貝類中A群輪狀病毒檢測方法 普通PCR和實時熒光PCR方法》、SN/T 2519—2010《貝類中星狀病毒檢測方法 普通PCR和實時熒光PCR方法》等國際標準、國家標準、行業標準分別規定的NoV（GI型和GII型）、HAV、RV、AstV檢測靶標，由華大基因合成同時含有上述4 種病毒檢測靶標RNA對應cDNA的串聯序列，命名為MulV。

參考GenBank數據庫中的Qβ噬菌體基因組序列（AB971354），由華大基因合成包含Qβ噬菌體成熟酶編碼基因、衣殼蛋白編碼基因、包裝位點序列、MulV的核酸片段，命名為QβMulV。

1.3.3 重組質粒構建與鑒定

將核酸片段MulV亞克隆至pGEM-T-Easy載體中，構建體外轉錄用重組質粒，酶切鑒定后送至華大基因測序。

參考同源重組克隆試劑盒的說明書，將核酸片段QβMulV亞克隆到pET-28a（+）載體中，構建原核表達用重組質粒，酶切鑒定后送至華大基因測序。

1.3.4 病毒樣顆粒的誘導表達

將原核表達用重組質粒轉入E. coli BL21（DE3）感受態細胞，涂布于含卡那霉素的LB固體培養基上，37 ℃過夜培養后挑取單菌落，接種到5 mL LB液體培養基中37 ℃、180 r/min振蕩培養過夜，取2 mL菌液接種于200 mL LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養至OD600nm約為0.6，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導表達12 h，離心收集菌液，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.5 病毒樣顆粒的純化

將1.3.4節收集的菌液采用超聲波破碎，4 ℃、11 000 r/min離心20 min收集上清后分別加入終濃度為8 U/mL的DNase I和12 μg/mL的RNase A消化，用0.45 μm濾膜過濾后進行氯化銫密度梯度離心，4 ℃、80 000 r/min離心5 h，小心吸取含VLPs的目標層液體，通過SephacryI S-200 HR層析柱進一步純化，用自動樣品收集器每10 min收集一管樣品。將各收集管樣品測定在260 nm和280 nm波長處的吸光度，并進行SDS-PAGE分析。獲得同時含有4 種食源性病毒檢測靶標的多聯裝甲RNA，命名為AR-MulV。

1.3.6 電鏡觀察

將AR-MulV用2%磷鎢酸負染，在JEM-1200型透射電子顯微鏡下觀察VLPs形態。

1.3.7 AR-MulV中殘留質粒的檢測

以純化后的AR-MulV為模板，用實時熒光定量PCR法檢測其中是否含有殘留重組質粒；同時設置pETQβMulV為陽性對照，無酶ddH2O為空白對照；每個樣品設置3 個平行。檢測用引物與探針參見表1，反應體系見表2，循環參數：95 ℃預變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸20 s，40 個循環。

1.3.8 AR-MulV的初步定值1.3.8.1 cRNA制備

用限制性內切酶線性化體外轉錄用重組質粒，用T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System試劑盒進行體外轉錄；體系如下：RioMAXTMExpress T7 2 μL，Buffer 10 μL，Linear DNA Template 8 μL，Enzyme Mix T7 Express 2 μL；37 ℃溫育30 min后，加入1 μL的RQ1 RNase-Free DNase，37 ℃溫育15 min，除去DNA模板。用Trizol法提取cRNA。

1.3.8.2 標準曲線構建

使用微量核酸蛋白測定儀測定cRNA的濃度。計算拷貝數按照：拷貝數/（copies/μL）＝（6.02×1023拷貝/mol×RNA含量/（ng/μL）×10-9）/（片段長度/bp×340），將cRNA進行10 倍梯度稀釋，用對應的引物與探針分別對4 種食源性病毒檢測靶標進行實時熒光定量RT-PCR分析，每個樣品設置3 個平行，體系見表3。循環參數為42 ℃反轉錄5 min，95 ℃變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸20 s，40 個循環。根據所測得的Ct值與cRNA各梯度稀釋拷貝數的對數繪制標準曲線。

表 3 4 種食源性病毒的實時熒光定量RT-PCR體系Table 3 Real-time RT-PCR system for detection of four foodborne viruses

1.3.8.3 初步定值與不確定度分析

將純化后的AR-MulV用無酶磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.2）適度稀釋，分裝到1.5 mL無酶離心管中，參考JJF 1006—1994《一級標準物質技術規范》的要求，隨機選取15 管AR-MulV，采用1.3.8.2節中的實時熒光定量RT-PCR方法分別測定各食源性病毒的Ct值，根據標準曲線，得到15 管AR-MulV中4 種食源性病毒5 個檢測靶標拷貝數，參考JJF 1006—1994中格布拉斯準則剔除可疑數據后，計算平均值，得到AR-MulV中各食源性病毒檢測靶標初步定值結果。不確定度分析參考JJF 1059—1999《測量不確定度表示指南》，采用A類不確定度評定方法，按照以下公式進行計算：

式中：tα（m-1）為顯著性水平α、自由度為m-1的t值；為單次測量的平均值；為測量的總平均值；m為測量次數。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建

圖 1 pGEM-MulV的酶切鑒定電泳圖Fig. 1 Enzyme digestion of pGEM-MulV

圖 2 pET-QβMulV的酶切鑒定電泳圖Fig. 2 Enzyme digestion of pET-QβMulV

分別用限制性內切酶Spe I單酶切和Spel I/Sph I雙酶切鑒定體外轉錄用重組質粒，大小與預期一致，電泳結果如圖1所示，測序結果正確，證實重組質粒構建成功，命名為pGEM-MulV。分別用限制性內切酶BamH I單酶切和BamH I/Hind III雙酶切鑒定原核表達用重組質粒，大小與預期一致，電泳結果如圖2所示，測序結果正確，證實重組質粒構建成功，命名為pET-QβMulV。

2.2 pET-QβMulV在大腸桿菌中的誘導表達

pET-QβMulV轉化入大腸桿菌BL21（DE3）后，經IPTG誘導表達，用SDS-PAGE檢測，在約14.1 kDa處出現一條明顯的重組蛋白表達條帶（圖3），大小與預期一致，表明Qβ噬菌體衣殼蛋白成功表達。

圖 3 表達產物的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expression product

2.3 樣品的純化

圖 4 丙烯葡聚糖凝膠層析純化不同收集管樣品吸光度分析結果Fig. 4 Absorbance of different fraction after purification by Sephacryl S-200 HR gel exclusion chromatography

圖 5 吸收峰附近樣品SDS-PAGE結果Fig. 5 SDS-PAGE analysis of samples around absorbent peak

如圖4所示，第21管在260 nm和280 nm波長處均有最大吸光度，說明該管中核酸（即靶標RNA）與蛋白（即VLPs）含量均最高，即該管中AR-MulV含量最高。第19～24管樣品的SDS-PAGE分析結果見圖5，可見第21、22管樣品在14.1 kDa處均有條帶且濃度高無雜帶，說明純化效果好。本研究選取第21管樣品用無酶PBS（pH 7.2）適度稀釋后進行后續實驗。

2.4 電鏡觀察結果

在電鏡下觀察純化后的AR-MulV，可見大量結構完整、大小均一的病毒樣顆粒，直徑約25 nm，與預期大小一致，結果如圖6所示。

圖 6 AR-MulV電鏡照片Fig. 6 Electron microscopy image of AR-MulV

2.5 AR-MulV中殘留質粒的檢測結果

圖 7 AR-MulV殘留質粒實時熒光定量PCR檢測結果Fig. 7 Real-time PCR for residual plasmid DNA detection in the AR-MulV

如圖7所示，以AR-MulV為模板，分別用4 種食源性病毒的5 個檢測靶標對應的引物和探針進行檢測的實驗組和空白對照組，在陰性判定Ct值內均未出現特異性擴增；以pET-QβMulV為陽性對照的實驗組每對引物與探針均出現明顯的特異性擴增，且Ct值均在陽性判定值內，說明純化的AR-MulV中無重組質粒殘留，純度良好。

2.6 AR-MulV初步定值

2.6.1 cRNA標準曲線的構建

以10 倍稀釋梯度的cRNA為模板，利用4 種食源性病毒的引物與探針，分別進行實時熒光定量RT-PCR檢測。以cRNA各稀釋梯度的對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標建立實時熒光定量RT-PCR的標準曲線，其線性方程見表4。

表 4 4 種食源性病毒的cRNA標準曲線Table 4 Calibration curves for cRNA of four foodborne virus

2.6.2 AR-MulV的初步定值與不確定度分析

用對應的實時熒光定量RT-PCR方法檢測15 管AR-MulV，計算獲得AR-MulV中該食源性病毒靶標核酸拷貝數，同時計算A類不確定度。定值結果見表5，AR-MulV中GI型NoV、GII型NoV、HAV、RV和AstV檢測靶標RNA的含量分別為（1.24±0.2）×107、（2.54±0.6）×107、（2.24±0.3）×107、（2.96±0.5）×107copies/μL和（3.19±0.4）×107copies/μL。

表 5 AR-MulV中4 種食源性病毒靶標RNA初步定值結果Table 5 Quantification of AR-MulV for 4 foodborne viruses

3 討 論

目前食源性病毒檢測標準中的陽性質控樣品主要有致弱的活病毒或cDNA/質粒DNA兩大類，前者需要進行病毒培養，存在一定生物安全隱患，并且需使用與目標病毒不同的引物、探針，操作繁瑣；后者無法監控病毒裂解、核酸提取、反轉錄等多個關鍵環節。此外，也有將體外轉錄cRNA作為陽性質控樣品[8-10,15]，雖然可以評價反轉錄的過程，但存在易降解的短板。利用裝甲RNA技術制備的陽性質控樣品在最大程度上模擬病毒粒子，可在檢測過程中添加到實際樣本或空白樣本中，對目標病毒的裂解、RNA提取、檢測等關鍵環節進行全程評價，無生物安全隱患，穩定性高。對于某些高變異性的RNA病毒，在確定檢測靶序列的前提下，可在28 d內構建、制備、純化出新的裝甲RNA[16]，在自身有合成基因、測序條件的實驗室，不考慮定值，只制備定性陽性質控樣品，周期可縮短至20 d；有研究表明，裝甲RNA的穩定性很好，在-20 ℃條件下至少可保存120～200 d[14,25]、-80 ℃條件下至少可保存300 d[14]，這種較短的制備周期與優良的穩定性也是裝甲RNA的重要優勢[16]。裝甲RNA技術完全可彌補致弱的活病毒、cDNA/質粒DNA和cRNA作為陽性質控樣品的不足[17-18]，因此該技術已成為RNA病毒核酸檢測陽性質控樣品研發的重要發展方向[18-21]，尤其對于烈性傳染性病毒、新發病毒和無法進行體外培養病毒而言有著無可替代的優勢，現已成功制備人體免疫缺陷病毒[13]、猴免疫缺陷病毒[22]、冠狀病毒[23]、口蹄疫病毒[24]、寨卡病毒[16]、腸道病毒[12]等重要病原的裝甲RNA。

本研究在純化了AR-MulV后，為明確其所含各食源性病毒檢測靶標RNA的拷貝數，使之今后能更好地用于定量評價檢測方法、儀器設備靈敏度等領域，探索性地對其進行初步定值研究。目前對于裝甲RNA的定值主要有3 種方式：1）使用線性化質粒DNA為模板構建標準曲線[22]；2）使用體外轉錄cRNA為模板構建標準曲線[25]；3）以制備的裝甲RNA提取的RNA為模板構建標準曲線[26-27]。有研究結果表明，體外轉錄的cRNA為標準品更接近樣本RNA的真實拷貝數[28]，所以本研究以體外轉錄的cRNA為模板構建標準曲線對制備的AR-MulV進行初步定值。結果表明，即使經過稀釋，AR-MulV所含的4 種食源性病毒的檢測靶標RNA均可達到107copies/μL。在技術成熟的實驗室，理論上講，100 mL的誘導菌液可制備10 L以上的107copies/μL高拷貝數的樣品，產量大。后期對其進行聯合定值，明確其穩定性、均勻性等重要特性后，將有望申報有證標準參考樣品。

NoV、HAV、RV、AstV這4 種食源性病毒已成為質檢、疾控、出入境等機構的重要檢測項目，本研究基于目前通行的國際標準、國家標準、行業標準中涉及的食源性病毒檢測靶標，制備多聯裝甲RNA，與分別制備的方法相比，節省時間與研究精力。此外，為滿足食品安全與公共衛生安全等領域的需要，多重實時熒光定量RT-PCR成為快速篩查食源性病毒的重要手段，目前國內外學者已成功建立了NoV、HAV、RV和AstV[1]，GI型和GII型NoV[29]，NoV、RV、HAV和柯薩奇病毒[30]，GI型、GII型NoV和HAV[31]等多重實時熒光定量RT-PCR檢測方法，能夠快速、特異、靈敏地同時檢測多種食源性病毒。在應用上述多重檢測方法時，如果對涉及到的每種食源性病毒均設置單一的陽性質控樣品，則需同時對多種相應的質控樣品分別添加、提取、擴增等，操作繁瑣，難以滿足應對突發性食品安全與公共衛生事件對檢測時效性的要求。針對上述需求，可基于本研究開發的多聯裝甲RNA研發平臺，根據多重實時熒光定量RT-PCR方法對應的擴增靶標序列，快速制備多聯裝甲RNA，滿足多種病毒的快速高通量檢測對陽性質控樣品的需求。多重實時熒光定量RT-PCR檢測方法與多聯裝甲RNA聯合使用，可縮短樣品檢測時間，提高檢測結果的可靠性。

綜上所述，本研究基于Qβ噬菌體裝甲RNA技術，成功研制出同時包含NoV、HAV、RV和AstV 4 種食源性病毒檢測靶標的多聯裝甲RNA，無殘留DNA，RNA拷貝數高，后期經穩定性、均勻性評價后，可作為多種病毒分子檢測的陽性質控樣品供質檢、科研人員選擇使用，為食源性病毒標準化檢測提供安全的標準參考樣品提供參考依據，也為多重實時熒光定量RT-PCR配套使用的多聯陽性質控樣品的制備提供了新思路。