Box-Behnken響應面法優化哈西奈德脂質體的制備工藝

林肖霞，蔡延渠，高建濱，蔡艷桃，蘇少琴

(1.佛山市南海區婦幼保健院，廣東 佛山 528200； 2.廣東藥科大學新藥研發中心，廣東 廣州 510006)

哈西奈德是一種皮質類固醇，具有良好的抗感染、抗過敏、抗瘙癢和血管收縮作用[1]。局部應用不易引起全身性不良反應，目前的劑型以液體制劑、乳劑和涂抹劑等為主[2]。皮膚的角質層是藥物經皮吸收的主要屏障，一般外用劑型通過添加促透劑增加經皮吸收效率，但促透劑又促進了藥物的全身吸收，容易增加藥物的不良反應[3]。脂質體是由兩性分子雙層膜包裹而成的具有一個或多個水性腔室的微泡，藥物制備成脂質體后，可有效提高藥物的穩定性和治療指數[4]，且脂質體具有皮膚組織靶向性、兼溶性、緩釋性和無毒性，非常適合外用藥物的劑型改造[5]。為了增加哈西奈德的經皮吸收率，降低促透劑的使用量，本研究制備了哈西奈德脂質體，采用Box-Behnken響應面法對其制備工藝進行優化，并考察其透皮性能。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SD大鼠，體質量(200±10)g，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心，合格證號：SYXK(粵)2017-0125。

高效液相色譜儀(日本島津)；SHA-C水浴恒溫振蕩器(金壇市宏華儀器廠)；BT25S電子天平(德國賽多利斯)；YB-P6智能透皮試驗儀(天津藥典標準儀器廠)；N-2110旋轉蒸發儀(東京理化株式會社)。

哈西奈德(上海麥克林生化科技有限公司)；膽固醇、VE、卵磷脂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；哈西奈德對照品(批號100146-201504，中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 方法

1.2.1 哈西奈德脂質體的制備及其包封率測定方法 稱取哈西奈德粉末100 mg，溶解于30 mL 0.05 mol/L PBS溶液(pH=7.5)，攪拌均勻，將溶液加熱至60 ℃，保持攪拌狀態。卵磷脂、膽固醇和VE依據不同實驗設計比例溶解于無水乙醇中，將此混合溶液使用滴管緩慢滴入哈西奈德溶液中，繼續攪拌30 min。旋轉蒸發去除乙醇后，超聲波細胞破碎儀破碎5 min(功率150 W，超聲5 s，停5 s)后，即可獲得哈西奈德脂質體，置于4 ℃保存待用[6]。

哈西奈德脂質體甲醇破膜后，按《中國藥典》收錄的黃體酮內標法[7]測定哈西奈德的質量濃度，色譜條件：Kromasil C18色譜柱，流動相為甲醇-水-乙醚(體積比76∶20∶4)，檢測波長為238 nm。哈西奈德脂質體甲醇破膜后，測定的哈西奈德質量濃度即為哈西奈德脂質體中藥物總量，超速離心法分離哈西奈德脂質體與游離哈西奈德，測定游離哈西奈德總質量，包封率=哈西奈德脂質體中藥物總量-游離哈西奈德質量/哈西奈德脂質體中藥物總量×100%。

1.2.2 單因素試驗 以哈西奈德脂質體包封率為指標，對哈西奈德∶磷脂(質量比，下同)、膽固醇∶磷脂(質量比，下同)、VE∶磷脂(質量比，下同)和乙醇用量進行單因素試驗。各因素選擇范圍分別如下：哈西奈德∶磷脂為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10，膽固醇∶磷脂為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10，VE∶磷脂為0∶10、0.5∶10、0.1∶10、0.15∶10、0.20∶10、0.25∶10，乙醇用量為1、3、5、7、9、11 mL。每個試驗重復3次。

1.2.3 Box-Behnken響應面優化設計 依據單因素試驗結果，采用Box-Behnken響應面優化制備工藝，選取A因素(哈西奈德∶磷脂)、B因素(膽固醇∶磷脂)、C因素(VE∶磷脂)和D因素(乙醇用量)，設計4因素3水平試驗方案，以包封率為響應值(Y)，并以-1、0、1分別代表變量的因素編碼，基于Box-Behnken響應曲面設計試驗方案按表1進行試驗，共29次試驗，采用Design expert 8.0對試驗結果進行分析。

表1Box-Behnken試驗因素水平和編碼

Table1Factor Level and Coding in Box-Behnken Test

因素水平-101A(哈西奈德∶磷脂)1∶102∶103∶10B(膽固醇∶磷脂)1∶102∶103∶10C(VE∶磷脂)0∶100.5∶101∶10D(乙醇用量/mL)357

1.2.4 體外透皮試驗 分別配制2.5 mg/mL的哈西奈德溶液和哈西奈德脂質體溶液。大鼠脫頸處死后，苦味酸去毛，取腹部兩側皮膚，剔除皮下脂肪。將皮膚置于透皮擴散裝置,皮膚角質層面對釋放池，真皮層面向接受池，釋放液為0.3 mL，接受液為5 mL，溫度為(37.5±0.5)℃，振速為150 r/min，分別于2、4、6、8、10、12 h取樣4 mL，并補足等量接受液，按下式計算累積透過量：

式中，Q為第n次取樣時的累積透過量；A為擴散面積(cm2)；Cn為n時間點取樣濃度；Ci為1，2，3…n-1時間點取樣濃度。

再按公式“累積透過率=累積透過量/哈西奈德總量×100%”計算累積透過率。

1.3 數據處理

2 結果

2.1 單因素試驗結果

從圖1的單因素試驗結果可見，哈西奈德∶磷脂為2∶10、膽固醇∶磷脂為1∶10、VE∶磷脂為0.5∶10、乙醇用量為5 mL時，哈西奈德脂質體具有最高的包封率。因此，在設計4因素3水平響應面優化試驗中，哈西奈德∶磷脂選擇1∶10、2∶10、3∶10，膽固醇∶磷脂選擇1∶10、2∶10、3∶10，VE∶磷脂選擇0∶10、0.5∶10、1∶10，乙醇用量選擇3、5、7 mL。

圖1各因素對哈西奈德脂質體包封率的影響

Figure1Effects of various factors on encapsulation rate of Hassinide liposomes

2.2 響應面法優化制備工藝結果

2.2.1 Box-Behnken響應面試驗設計優化結果

Box-Behnken試驗方案及結果見表2。

表2Box-Behnken響應面試驗設計與結果

Table2Design and results of Box-Behnken response surface experiments

編號因素ABCD包封率/%12∶102∶100.5∶10455.35222∶102∶100∶10558.03131∶102∶100∶10457.87242∶102∶101∶10344.72252∶101∶101∶10440.43462∶102∶101∶10552.65771∶102∶100.5∶10348.17683∶102∶100.5∶10564.21591∶103∶100.5∶10459.353101∶102∶101∶10449.707112∶101∶100∶10436.915122∶102∶100∶10338.744131∶102∶100.5∶10541.526143∶102∶100∶10439.790152∶101∶100.5∶10330.673162∶103∶100.5∶10344.55172∶102∶100.5∶10459.236182∶103∶100.5∶10450.107192∶101∶101∶10544.196202∶102∶100.5∶10458.059212∶103∶100.5∶10554.367222∶102∶100.5∶10451.157233∶101∶100.5∶10435.379243∶102∶100.5∶10332.129251∶101∶100.5∶10428.853263∶103∶100.5∶10443.478272∶102∶100.5∶10453.807283∶102∶101∶10451.812292∶103∶100∶10455.062

2.2.2 模型建立與回歸分析 采用Design-expert 8.0.6.1對實驗數據進行回歸分析，建立的二次多元回歸方程如下：

Y=81.61+2.02A-0.90B-1.09C-1.67D-2.67AB+3.38AC+1.94AD+2.89BC-1.63BD+0.21CD-9.91A2-4.65B2-4.71C2-3.94D2。

對方程的回歸分析結果(表3)顯示：模型的F值為5.98，P<0.001，表明模型具有顯著性，只有0.10%的概率是由于噪聲導致F值偏大；失擬項的數值為0.088 2，>0.05，表明失擬項對于誤差不顯著，回歸方程擬合度較好。模型決定系數為R2=0.713 6，表明該模型可以解釋響應面中85.68%的可變性；模型中，哈西奈德∶磷脂-VE∶磷脂、哈西奈德∶磷脂-哈西奈德∶磷脂、膽固醇∶磷脂-膽固醇∶磷脂、VE∶磷脂-VE∶磷脂、乙醇-乙醇之間的相互作用對哈西奈德脂質體包封率均具有顯著影響(P<0.05或P<0.01)。

響應面曲線圖可直觀反映響應值和試驗參數之間的相關關系，圖2分別是哈西奈德∶磷脂、膽固醇∶磷脂、VE∶磷脂、乙醇用量之間的相互作用對脂質體包封率的響應面圖。

2.2.3 驗證試驗 通過響應面分析，得到最優制備工藝如下：哈西奈德∶磷脂為2.1∶10，膽固醇∶磷脂為1.9∶10，VE∶磷脂為0.4∶10，乙醇用量為4.66 mL，預測包封率為81.95%。對最優制備工藝進行3次驗證試驗，得到實際包封率為(79.25±4.24)%，與理論值的誤差為2.7%。

2.3 哈西奈德脂質體的表征

哈西奈德脂質體的表征結果顯示，哈西奈德脂質體形態圓整，粒徑分布均勻，平均粒徑為(148.2±10.3)nm，Zeta電位為41.67 mV，見圖3。

2.4 哈西奈德脂質體透皮性能分析

從表4可見，哈西奈德脂質體組的2、4、6、8、10、12 h累積透過量和累積滲透率均顯著高于對照組。

表3 回歸分析結果Table 3 Regression analysis of experiment results方差來源平方和自由度均方F值P值模型979.4514979.455.98<0.001A49.05149.054.190.059 8B9.6819.680.830.378 2C14.15114.151.210.289 9D33.50133.502.870.112 6AB28.46128.462.430.141 0AC45.70145.703.910.048 1AD15.20115.201.280.276 1BC33.35133.352.850.113 4BD10.56110.560.900.358 0CD0.1710.170.0140.906 3A2636.501636.5054.44<0.000 1B2140.461140.4612.010.003 8C2143.721143.7212.290.003 5D2100.931100.938.630.010 8失擬項149.581014.960.910.088 2

A.哈西奈德∶磷脂-膽固醇∶磷脂; B.哈西奈德∶磷脂-VE∶磷脂; C.哈西奈德∶磷脂-乙醇; D.膽固醇∶磷脂-VE∶磷脂; E.膽固醇∶磷脂-乙醇;F.VE∶磷脂-乙醇

圖2各因素交互作用對哈西奈德脂質體包封率的影響
Figure2Response surface curves of encapsulation efficiency of Hassinide liposomes by two-factor interactions

A.脂質體粒徑分布圖； B.脂質體電位分布圖； C.脂質體透射電鏡圖。

與溶液組比較：**P<0.01。

3 討論

目前，脂質體已被應用于多種外用藥物，如丁卡因脂質體[8]、維甲酸脂質體[9]、鬼臼毒素脂質體[10]和氫化可的松脂質體[11]等。通過制備脂質體可有效改善藥物的經皮吸收性能。本研究采用乙醇注入-超聲法制備了哈西奈德脂質體。影響脂質體制備的因素眾多，單因素實驗不能考察因素與因素之間的相互影響，正交試驗注重于科學的安排試驗，尋找最佳的因素水平組合，但考慮因素之間的交互作用時，試驗次數將顯著增加。為此，本研究采用響應面分析法對工藝進行了優化。

響應面分析法是通過對響應面等值線的分析尋求最優工藝參數，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間函數關系，并通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法[12]，廣泛應用于生物學、食品學及醫藥學等領域[13]。本研究以包封率為響應值，對哈西奈德脂質體的制備工藝進行了優化，通過單因素試驗設定4因素3水平試驗，共29次試驗，為避免實驗操作帶來的異常誤差，每次實驗均測定了脂質體的粒徑，使單次結果脂質體粒徑變化控制在10%內。

傳統脂質體制備采用三氯甲烷、乙醇和甲醇等有毒有機試劑，本研究采用了無毒的乙醇進行制備哈西奈德脂質體，乙醇可以降低脂質體之間的水合力，乙醇過量可導致脂質體的聚集融合[14]。脂質體膜的組成極大影響脂質體的包封率，磷脂加入一定比例的膽固醇可以增加脂質雙分子膜中分子間的緊密程度，但過量導致膜不對稱性，導致藥物泄漏。磷脂中的不飽和酰基鏈易氧化，因此需在制備過程中加入一定的抗氧化穩定磷脂，VE是一種常見的脂質體抗氧化劑，但過量使用會使脂質體的形成難度增大[15]。因此，本研究分別選擇了哈西奈德∶磷脂、膽固醇∶磷脂、VE∶磷脂和乙醇用量進行了優化。

脂質體具有雙親性，通過包封可增加藥物的溶解度，促進藥物的經皮吸收，并在角質層形成藥物貯庫，緩釋藥物，避免藥物大量進入血液，引起全身性反應。為此，本研究考察了哈西奈德脂質體的經皮吸收性能，結果顯示哈西奈德脂質體組2、4、6、8、10、12 h累積透過量均顯著高于溶液組，累積滲透率可達到對照組的2.75倍，具有良好的經皮吸收性能。