不同水蒸氣蒸餾輔助方法對(duì)馬來沉香揮發(fā)油化學(xué)組成的影響

易潤青，陳興靜，楊思惠，黃圓圓，高曉霞，陳曉穎

(1. 廣州市醫(yī)藥職業(yè)學(xué)校，廣東 廣州 510430； 2.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

沉香既是極其珍貴的藥材又是名貴的天然香料，具有濃郁優(yōu)雅的獨(dú)特香氣[1]。沉香分為進(jìn)口沉香和國產(chǎn)沉香，進(jìn)口沉香原植物為瑞香科植物沉香AquilariaagallochaRoxb.[2]，主要產(chǎn)于印度、印尼和馬來西亞等地；國產(chǎn)沉香原植物為瑞香科植物白木香Aquilaria.sinensis(Lour.) Gigl[3]，主要產(chǎn)于我國廣東、廣西、海南、云南和臺(tái)灣等省區(qū)。

馬來沉香AquilariamalaccensisLamk.主產(chǎn)于馬來西亞、印尼、泰國，目前，AquilariaagallochaRoxb.已經(jīng)被歸并為AquilariamalaccensisLamk.[4]。馬來沉香揮發(fā)油主要化學(xué)組成為倍半萜類和芳香族類化合物。Jayachandran等[5]采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析不同等級(jí)馬來沉香揮發(fā)油，結(jié)果表明高等級(jí)馬來沉香油中香橙烯、2-瓦倫烯、白菖烯和斯巴醇等倍半萜類化合物占總氣化組分的74.03%，低等級(jí)馬來沉香中T-杜烯醇、香橙烯、2-瓦倫烯等倍半萜類化合物占總氣化成分的43.47%，由此可見，品質(zhì)好的沉香油倍半萜類化合物相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)更高。

用常規(guī)的水蒸氣蒸餾方法耗費(fèi)時(shí)間較長，揮發(fā)油最終得率小，一般不超過0.1%。為了提高沉香揮發(fā)油的得率，王健松等[6]采用CO2超臨界流體萃取中山國產(chǎn)沉香木，得油率為1.05%，其中倍半萜類化合物僅占7.39%，2-(2-苯乙基)色酮類化合物占22.678%；鄧紅梅等[7]采用CO2超臨界流體萃取電白的國產(chǎn)沉香油，產(chǎn)率0.62%，其中54.22%為脂肪酸，倍半萜類化合物只占10%左右。梅文莉等[8]用乙醚提取5種國產(chǎn)沉香揮發(fā)油，得率在1.7%～5.0%，主要成分包括倍半萜類化合物(11.9%～33.4%)、芳香族化合物(5.0%～20.8%)和脂肪酸類化合物(12.9%～44.2%)。袁觀富等[9]采用低溫微波提取海南國產(chǎn)沉香，得率約為0.6%，其中約40%為十氫柰型倍半萜類化合物。陳志雄等[10]采用動(dòng)態(tài)微波提取市售沉香木，得率為0.68%。微波提取所得粗提物中含有大量膠質(zhì)，需用吸附劑除去。李明月等[11]采用果皮酶處理沉香木后再用乙醇索氏提取沉香揮發(fā)油，濃縮干燥后稱重計(jì)算，得率高達(dá)21.33%，其中80%以上為2-(2-苯乙基)色酮類化合物。由此可見，除水蒸氣蒸餾外的提取方法所得沉香揮發(fā)油雖然得率提高了，但其中倍半萜類化合物的含量大多不高，所得沉香揮發(fā)油的品質(zhì)欠佳。

弓寶等[12]采用纖維素酶酶解后石油醚提取國產(chǎn)沉香油，得率從0.062%上升至0.1621%；劉東峰等[13]采用復(fù)合酶酶解后的微波提取來萃取沉香油，得率能達(dá)到1%左右；唐顯[14]采用復(fù)合菌種發(fā)酵液浸泡沉香木15 d后再用水蒸氣蒸餾提取沉香油，平均得率從0.23%提高到0.48%。由此可見，采用酶解、微波、發(fā)酵液浸泡等方法可提高沉香油的得率，但這幾種輔助方法對(duì)沉香揮發(fā)油化學(xué)組成的影響情況未見報(bào)道。

本文以水蒸氣蒸餾為基礎(chǔ)，分別采用纖維素酶酶解、微波輔助、內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡、微波結(jié)合內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡不同輔助方法提取馬來沉香揮發(fā)油，分析各提取方法馬來沉香揮發(fā)油的化學(xué)組成，以期篩選出最佳的馬來沉香揮發(fā)油提取方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；WBFY-205微波化學(xué)反應(yīng)器(予華儀器有限責(zé)任公司)；HH-6數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(宏華儀器廠)；JA2003A 1/1000電子天平(精天電子儀器)。

1.2 試藥

進(jìn)口沉香1批，經(jīng)由廣東藥科大學(xué)生物資源與藥物開發(fā)中心朱爽副教授鑒定為馬來沉香AquilariamalaccensisLamk.[15]。按照國家藥品監(jiān)督管理局2004年頒布的《兒茶等43種進(jìn)口藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中的有關(guān)規(guī)定[2]進(jìn)行全檢，其結(jié)果符合進(jìn)口沉香藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

纖維素酶(上海源葉生物科技公司，酶活性：400 U/mg)；BotrysphaeriarhodinaA13發(fā)酵液(廣東省微生物研究所李浩華副研究員鑒定并提供)；正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品C7～C40(編號(hào)DRH-008SR2，AccuStandard公司，三氯甲烷中1000 mg/L)；乙醚(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH5.0)。

2 方法

2.1 提取方法與供試品溶液的制備

2.1.1 水蒸氣蒸餾法(方法一) 精密稱取沉香粗粉(過2號(hào)篩，且不過3號(hào)篩)約20 g，置于500 mL圓底燒瓶內(nèi)，加入120 mL水，充分振蕩搖勻后，靜置12 h。將揮發(fā)油測(cè)定器和冷凝管相連，從冷凝管的上端位置向管中不斷加水，使水超過揮發(fā)油測(cè)定器刻度，當(dāng)水溢進(jìn)燒瓶時(shí)停止添加。將燒瓶放置在電熱套里緩慢加熱直到沸騰，同時(shí)維持微沸狀態(tài)8 h左右，靜置，冷卻。加入少量乙醚收集得到的揮發(fā)油，洗滌液置于5 mL量瓶，加乙醚至刻度，搖勻，得供試品溶液1。

2.1.2 纖維素酶酶解輔助水蒸氣蒸餾法(方法二) 精密稱取沉香粗粉(過2號(hào)，且不過3號(hào)篩)約20 g和纖維素酶0.024 g，置于500 mL圓底燒瓶內(nèi)，加醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)100 mL，50 ℃水浴加熱，酶解2 h，加水20 mL，自“將揮發(fā)油測(cè)定器和冷凝管相連”起按“2.1.1”項(xiàng)下方法操作，得供試品溶液2。

2.1.3 微波輔助水蒸氣蒸餾法(方法三) 精密稱取沉香粗粉(過2號(hào)，且不過3號(hào)篩)約20 g，置于500 mL圓底燒瓶內(nèi)，加入120 mL水，微波300 W加熱2 min后，靜置12 h，自“將揮發(fā)油測(cè)定器和冷凝管相連”起按“2.1.1”項(xiàng)下方法操作，得供試品溶液3。

2.1.4 內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡輔助水蒸氣蒸餾法(方法四) 精密稱取沉香粗粉(過2號(hào)，且不過3號(hào)篩)約20 g，置于500 mL圓底燒瓶內(nèi)，加內(nèi)生真菌發(fā)酵液100 mL，35 ℃發(fā)酵3 d，加水20 mL，自“將揮發(fā)油測(cè)定器和冷凝管相連”起按“2.1.1”項(xiàng)下方法操作，得供試品溶液4。

2.1.5 微波結(jié)合內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡輔助水蒸氣蒸餾法(方法五) 精密稱取沉香粗粉(過2號(hào)，且不過3號(hào)篩)約20 g，置于500 mL圓底燒瓶內(nèi)，用少量水濕潤后，微波300 W加熱2 min，放冷，加內(nèi)生真菌發(fā)酵液100 mL，35 ℃發(fā)酵3 d后，加水20 mL，自“將揮發(fā)油測(cè)定器和冷凝管相連”起按“2.1.1”項(xiàng)下方法操作，得供試品溶液5。

2.2 正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品溶液的制備

精密移取正構(gòu)烷烴C7～C40混合對(duì)照品20 μL置2 mL量瓶中，用三氯甲烷定容至刻度，搖勻，制成10 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，-20 ℃避光保存，備用。

2.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為HP-5 MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；載氣：高純度氦氣；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL；進(jìn)樣采用不分流方式。升溫程序：90 ℃，保溫4 min，以1.5 ℃/min升溫至130 ℃，保溫20 min后以0.5 ℃/min升溫至160 ℃，保溫5 min后以1 ℃/min升溫至180 ℃，保溫5 min后以2 ℃/min升溫至230 ℃，保溫30 min。

2.3.2 質(zhì)譜條件 調(diào)諧方式：標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧方式；離子源：EI；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；電離電壓：1.0 kV；接口溫度：240 ℃；質(zhì)量掃描范圍：50～500m/z，溶劑延遲時(shí)間：5 min。

2.4 樣品測(cè)定

依照“2.3”項(xiàng)下的色譜與質(zhì)譜條件對(duì)“2.1”項(xiàng)下的5種供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。

2.5 數(shù)據(jù)處理

將正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品(C7～C40)溶液和供試品溶液在同一色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣。通過儀器自帶的GC-MS Postrun Analysis進(jìn)行積分處理，得峰面積。分別求出各類成分以及試樣的總峰面積，完成整理對(duì)比。用自動(dòng)質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System，AMDIS)處理樣品的總離子流圖，去除噪音和圖譜重疊的干擾，結(jié)合NIST05數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜信息比對(duì)和保留指數(shù)RI(Retention Index)校正，進(jìn)行組分的鑒定。

3 結(jié)果與分析

不同輔助提取方法制備的沉香揮發(fā)油供試品GC-MS總離子流圖如圖1所示，各色譜圖總峰面積比較結(jié)果見圖2。可見，4種輔助水蒸氣蒸餾提取方法均能提高揮發(fā)油總量，其中纖維素酶酶解輔助提高最多，其次為微波結(jié)合內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡。

圖1不同輔助提取方法的GC-MS總離子流圖

Figure1Total GC-MS ion flow diagrams of different auxiliary extraction methods

由表1可見，不同提取方法制備的沉香揮發(fā)油的出峰數(shù)目分別為105、133、99、111、103；檢出物個(gè)數(shù)均為30；檢出物總相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為73.157%、67.381%、74.173%、75.798%、76.524%；其中芳香族類化合物分別為4.258%、4.519%、3.883%、10.425%、4.662%；倍半萜類化合物分別為68.542%、62.702%、69.951%、64.975%、71.334%；倍半萜類化合物總相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是微波結(jié)合內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡輔助方法(71.334%)，最低的是纖維素酶酶解輔助提取方法(62.702%)。

將表1中各方法中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的7種化合物進(jìn)行比較，結(jié)果見圖3。由圖3可見,5種方法所得沉香揮發(fā)油中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的已檢成分均為喇叭醇。除內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡方法中芐基丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較其他方法稍高外，其他4種方法相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的依次為γ-桉葉醇、馬兜鈴烯、桉烷型、沉香螺醇、芐基丙酮、愈創(chuàng)木烯。由此可見，4種輔助水蒸氣蒸餾提取方法所得沉香揮發(fā)油的化學(xué)成分組成與水蒸氣蒸餾方法差別不大。

圖2不同輔助提取方法所得GC-MS色譜總峰面積比較圖

Figure2The comparison of total peak area of GC-MS chromatogram obtained by different auxiliary extraction methods

圖3不同輔助提取方法中沉香揮發(fā)油主要化合物的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較圖

Figure3The comparison of the relative percentages of the main compounds of the volatile oil of agarwood by different auxiliary extraction methods

表1 不同輔助提取方法沉香精油樣品的成分鑒定及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Identification and relative content of volatile oil samples from different extraction methods

表1 (續(xù))

注：[a]為NIST庫中檢索的化合物的RI值；[b]為計(jì)算的RI值。

4 討論

本文5種提取方法獲得的沉香揮發(fā)油中主要成分均為倍半萜類化合物，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的γ-桉葉醇、沉香螺醇、α-愈創(chuàng)木烯、芐基丙酮和欖香醇為馬來沉香揮發(fā)油的主要成分[16]，倍半萜類化合物占?xì)饣M分的70%左右，接近Jayachandran等[5]劃分的高等級(jí)馬來沉香揮發(fā)油(倍半萜類化合物占總氣化組分的74.03%)。

纖維素酶酶解輔助水蒸氣蒸餾可以通過酶解破壞細(xì)胞壁，達(dá)到有效增加揮發(fā)油提取量的目的，但酶解操作繁瑣，提取過程會(huì)出現(xiàn)大量的泡沫，增加提取工藝難度。微波是利用微波輻射破壞樣品的細(xì)胞壁，使揮發(fā)油溶出，具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、加熱效率高、受熱時(shí)間短等特點(diǎn)，可以極大加快反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間，有效提高得率[17-18]。菌群與沉香粉末混合發(fā)酵，可大幅度提高沉香油的提取率[14]。本文研究結(jié)果表明，微波輔助、內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡及微波結(jié)合內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡均能增加沉香揮發(fā)油的提取量，其中微波加熱結(jié)合內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡輔助水蒸氣蒸餾法提取的倍半萜相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，在馬來沉香揮發(fā)油的提取中可發(fā)揮較好的作用，但具體提取工藝尚待進(jìn)一步優(yōu)化。

致謝：文中所用沉香樣品由馬來西亞 Feng Yang Biontech(M) Sdn.Bhd吳光明先生提供。