黃花敗醬總皂苷的HPLC-Q-TOF MS成分分析

陳淑玲，王曉玉，鐘艷梅，李衛東，4，韓亮，4

(廣東藥科大學 1.中藥學院; 2.健康學院; 3.中心實驗室，廣東 廣州 510006； 4.廣東省光與健康工程技術研究中心，廣東廣州 510310)

黃花敗醬為敗醬科(Valerianaceae)敗醬屬(Patrinia)黃花敗醬(PatriniascabiosaefoliaFisch)的根或帶根全草，在我國分布廣泛[1]，味辛、性寒，始載于《神農本草經》，具有清熱利濕、解毒排膿、祛瘀止痛的功效[2]。現代藥理研究表明，黃花敗醬具有抗菌[3]、抗病毒、抗感染、保肝利膽、抗腫瘤和抗氧化等作用[4-5]，臨床上常用于治療潰瘍性結腸炎、闌尾炎和慢性胃炎等[6]。據文獻報道，黃花敗醬醇提物對潰瘍性結腸炎具有顯著的改善和治療作用[7]；本課題組前期研究結果也顯示，黃花敗醬總皂苷提取物對三硝基苯磺酸致大鼠潰瘍性結腸炎具有明顯的改善和治療作用，不僅能顯著降低炎癥結腸組織的TNF-α、IL-1β含量、MPO活性和MDA水平，而且能明顯升高SOD活性[8-9]；從黃花敗醬根部分離得到的皂苷類化合物能夠提高血清轉氨酶的活性，抑制肝炎病毒的活性，其苷元齊墩果酸更被認為是抗肝炎的強活性成分[10]：因此，推測黃花敗醬皂苷類成分可能為其抗感染主要藥效活性成分。

目前，黃花敗醬的藥效物質基礎尚不明確[11-12]，對黃花敗醬皂苷類成分的研究報道尚少，為了進一步揭示黃花敗醬藥效物質基礎，開發其藥用價值，本研究采用高效快速、高靈敏度的HPLC-Q-TOF MS方法對黃花敗醬總皂苷部位的化學成分進行了鑒別分析，為黃花敗醬的進一步開發和利用奠定理論基礎。

1 儀器與材料

黃花敗醬(500 g)，購自廣州至信藥業股份有限公司，批號為：170701，經廣東藥科大學中藥學院王鳳云老師鑒定為黃花敗醬(PatriniascabioscaefoliaFisch)的帶根全草。黃花敗醬總皂苷部位(由本課題組前期研究所得的最佳提取純化工藝所制得)。黃花敗醬皂苷C(Scabioside C)對照品(質量分數98.49%，成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17103006)；齊墩果酸對照品(質量分數≧98%，成都普菲德生物技術有限公司，批號：121213)；乙腈(色譜純，德國Merk公司)；甲酸(色譜級，德國Merk公司)；甲酸銨(色譜級，美國aladdin公司)。

HPLC-Q-TOF MS聯用儀(美國安捷倫公司)，色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

稱量黃花敗醬總皂苷30 mg于2 mL EP管中，加70%(體積分數，下同)甲醇溶解并超聲10 min，12 000 r/min高速離心，取上清液，即得。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取黃花敗醬C對照品0.1 mg，加70%甲醇水溶液1 mL，得對照品溶液。

2.3 色譜及質譜條件

色譜條件：色譜柱為ACQYITY UPLCTM BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；柱溫為35 ℃；進樣量為3 μL；流速為0.3 mL/min；波長為330 nm；以0.1%甲酸-10 mmol/甲酸銨為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫(0～4 min，98%～85%A；4～9 min，85%～80%A；9～11 min，80%～78%A；11～15 min，78%～50%A；15～18 min，50%～30%A；18～22 min，30%～10%A；22～25 min，10%～0%A；25～30 min，100%B)。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子采集模式，毛細管電壓為3 500 V，錐孔電壓為35 V，干燥氣流速為8 L/min，干燥氣溫度為320 ℃，掃描范圍(m/z)為100～1 500，MS/MS二級掃描碰撞能為20 V。

2.4 數據分析

采用Qualitative Analysis B.0 7.00軟件分析各化學成分的保留時間及其質譜信息，并結合分子離子峰與對照品、文獻報道的數據進行對比，再通過與Scifinder、Massbank和Chemspider等數據庫進行峰匹配檢索，對其中的化學成分進行有效辨別。

3 結果

對黃花敗醬總皂苷部位進行了正離子一級全掃描(50～1 500)及二級質譜掃描，色譜掃描檢測時間為30 min，色譜峰分離較好，如圖1所示。對其中的27個峰進行了分析鑒定，結果見表1。

本研究對27個色譜峰進行了識別鑒定，主要通過分析各色譜峰的一級和二級質譜圖，獲取各個成分的高分辨質譜分子量及分子式信息，通過Science finder、Massbank、Chemspder等數據庫的檢索并結合有關文獻的比對，最終鑒定了以下化學成分(見表1)。以下以峰24為例說明分析過程。

數據處理采用Qualitative Analysis B.07.00分析軟件，從圖2可見，峰24的分子離子峰為m/z767.439 9[M+H]+，由高分辨質譜給出其元素組成(預測分子式)為C41H66O13。從圖3可看到，在二級質譜中出現了m/z605、587、456、455及437等特征碎片離子，推測m/z605 [M+H-glc]+由[M+H]+脫去一分子葡萄糖形成，m/z587[M+H-glc-H2O]+由[M+H]+脫去一分子葡萄糖和水形成，m/z456[M+H-glc-ara]+由[M+H]+脫去一分子葡萄糖和一分子阿拉伯糖形成，m/z455由m/z456 [M+H-glc-ara]+脫去一個H形成，m/z437在m/z455基礎上再脫去一個H2O形成，推測峰24化合物可能的裂解途徑如圖4所示。通過查找Science finder、Massbank、Chemspder等數據庫檢索以及文獻和標準品信息對比，峰24分子量、分子式及其質譜裂解行為與文獻[13]報道和標準品黃花敗醬皂苷C一致，故推斷峰24所對應的化合物為黃花敗醬皂苷C。

圖1 黃花敗醬總皂苷部位在正離子模式下的總離子流圖Figure 1 Total ion current diagram of the total sapo-nins of Patrinia scabiosaefolia Fisch in posi-tive ion mode

圖2 峰24的ESI-MS圖譜Figure 2 The ESI-MS spectrum of peak 24

圖3 峰24的ESI-MS/MS圖譜Figure 3 The ESI-MS/MS spectrum of peak 24

注：glc代表葡萄糖，ara代表阿拉伯糖。

圖4黃花敗醬皂苷C(峰24)可能的裂解途徑

Figure4Possible cleavage pathway of Scabioside C (peak 24) (Note:glc stands for glucose and ara stands for arabinose)

同理，通過與數據庫、對照品和文獻數據比較，識別鑒定出了其余26個峰，初步鑒定出了每個峰所對應的化合物，其中三萜皂苷類成分10種[14]，甾體皂苷2種，甾醇類3種，單萜類4種，有機酸類2種，糖苷類2種，黃酮類1種，其他類3種，其中4個化合物(蕓苔甾醇-D-葡萄糖苷、孕烷，β-D-核糖-己吡喃糖苷衍生物，Astraeusin C、孕烷，β-D-吡喃葡萄糖醛酸衍生物)為黃花敗醬成分分析的首次報道，化合物鑒定結果見表1。

表1 黃花敗醬總皂苷的化學成分分析Table 1 Chemical composition analysis of total saponins of Patrinia scabiosaefolia Fisch

4 討論

本研究所使用的黃花敗醬總皂苷部位由本課題組前期研究所優化過的總皂苷提取純化工藝所制得，故所含的皂苷類含量較高，適用于本研究的分析。本研究采用HPLC-Q-TOF MS聯用技術，快速、全面地識別了黃花敗醬總皂苷部位中的主要化學成分。釆用正離子模式進行全掃描檢測，發現總皂苷純化部位成分在正離子模式下峰信息量大，質譜響應較強，可能與其中的皂苷類含量較高有關。通過高分辨質譜信息，共分離和初步鑒定出了黃花敗醬大孔樹脂純化部位中的27種化合物：三萜皂苷類成分10種，甾體皂苷2種，甾醇類3種，單萜類4種，有機酸類2種，糖苷類2種，黃酮類1種，其他類3種，當中的4個化合物(蕓苔甾醇-D-葡萄糖苷、孕烷，β-D-核糖-己吡喃糖苷衍生物，Astraeusin C、孕烷，β-D-吡喃葡萄糖醛酸衍生物)為黃花敗醬成分分析的首次報道。目前，關于黃花敗醬藥效物質基礎的報道不多，本研究也為黃花敗醬的定性分析及進一步闡明其藥效物質基礎及質量控制提供有力的理論支撐和可借鑒的方法。